多功能纳米花辅助的催化发夹组装实现细胞外囊泡来源微小RNA谱分析用于结直肠癌诊断

《Talanta》：Multifunctional Nanoflower-assisted Catalytic Hairpin Assembly Enables Extracellular Vesicles derived-microRNAs Profiling for Colorectal Cancer Diagnosis

**摘要**• 开发了一种纳米花辅助CHA策略用于sEV-miRNA检测。• DNA纳米花实现了局部化CHA和高效的信号分子富集。• 该平台实现了23.65 aM的检测限。• 机器学习辅助的2种sEV-miRNA组合对早期结直肠癌诊断的AUC达到0.996。**引言**结直肠癌（CRC）持续成为全球重大健康威胁，2022年报告约193万新发病例和90.4万例死亡[1]。CRC可能无症状进展超过十年，早期检测对提高生存率至关重要[2]。目前的筛查主要依赖粪便检测和影像学检查，但前者敏感性和特异性仅处于中等水平，后者成本高昂[3]、[4]。这些局限性阻碍了大规模筛查，凸显了迫切需要更精确的诊断方法[5]。小型细胞外囊泡（sEVs）是一类直径通常小于200 nm的膜结合颗粒。它们在调节多种病理过程（如肿瘤进展和转移）中发挥重要作用[6]、[7]、[8]、[9]。sEVs来源的分子已成为癌症诊断的潜在候选者，包括蛋白质、脂质和核酸[10]、[11]、[12]。在这些分子中，sEV来源的微小RNA（sEV-miRNAs）因其在中生物流体中的显著稳定性而备受关注[13]。近期研究还表明，多种sEV-miRNAs在CRC发展过程中表现出异常表达[14]、[15]、[16]。与健康个体相比，CRC患者体内几种sEV-miRNAs水平上调，包括miR-1246、let-7a、miR-21和miR-223[17]。这些不同的表达水平表明sEV-miRNAs作为早期CRC诊断生物标志物的临床潜力。尽管sEV-miRNAs前景广阔，但其临床应用仍具挑战性，因为其丰度极低，需要高灵敏度和准确靶标识别的检测方法。电化学生物传感因其通用性、固有灵敏度和操作简便性而广受关注[18]、[19]、[20]。多种扩增策略已整合到电化学平台中，用于检测低丰度的sEV-miRNAs，包括纳米材料[21]、[22]、[23]、CRISPR/Cas系统[24]、[25]、酶辅助[26]和无酶扩增[27]。其中，催化发夹组装（CHA）因其可编程性和高信噪比而成为强有力的工具[28]。尽管CHA显著提高了检测灵敏度，但其实用性能常受限于中等反应动力学。为了解决动力学限制，已开发各种局部化策略来空间限制CHA反应物，从而增加分子碰撞并提高反应效率。例如，Zhang等人报道了DNA纳米线引导的CHA可通过高效渗透性和空间限制来增强sEV-miRNAs原位检测的分析灵敏度[29]。类似地，已开发出基于DNA四面体辅助CHA的超灵敏平台用于sEV-miRNAs检测[30]。Pan等人表明磁性微球也可增加局部浓度和反应动力学[31]。然而，这些策略仍面临结构性或实用性挑战。DNA纳米线受限于二维结构，相对限制了扩散效率。DNA四面体提供的锚定位点有限；磁性微球则常涉及复杂程序。因此，在制备简便性和分析灵敏度之间实现最优平衡仍具挑战性。在本研究中，我们开发了一种用于CRC诊断中超灵敏sEV-miRNAs检测的电化学平台。如图1所示，该平台利用多功能纳米花辅助催化发夹组装（NF-CHA）策略驱动高效的信号扩增。与先前工作[32]相比，我们通过滚环扩增（RCA）衍生的DNA纳米花在单一结构中发挥多重作用。首先，它可一步合成并直接与CHA发夹杂交，无需额外修饰。其次，它提供更多的可及锚定位点，增加了发夹探针的局部浓度并促进局部CHA反应。第三，纳米花及其表面的密集双链DNA充当支架，为RuHex静电结合提供丰富的磷酸骨架，从而产生高电化学信号。此外，机器学习算法用于分析数据以准确识别和分期CRC。总体而言，我们的研究结果表明，利用电化学平台分析sEV-miRNAs能够实现准确的CRC分期，并显示出癌症筛查和诊断的强大潜力。**章节摘要****试剂与仪器**表S1中详述的所有DNA和RNA序列均由北京百 Genome 基因科技有限公司（北京，中国）商业生产。关键试剂包括4S Red Plus核酸染料、6×上样缓冲液和500 bp DNA Marker，购自大连宝生物公司。Thermo Fisher Scientific Inc.（上海，中国）提供磷酸缓冲盐水（PBS），Biosharp（安徽，中国）提供TE缓冲液。Tris-HCl缓冲液由10 mM Tris、100 mM NaCl和5 mM MgCl?配制（pH = 7.4）。**电化学生物传感器设计原理**纳米花作为CHA反应的局部化支架和信号分子载体。图1A展示了NF-CHA的制备过程。纳米花通过滚环扩增（RCA）合成。每个纳米花包含大量重复序列，可与CHA发夹杂交，发夹通过碱基配对相互作用固定在纳米花表面。当靶标sEV-miRNA存在时，H1和H2之间发生托ehold介导的链置换（TMSD）……**讨论**总之，我们开发了一种结合超灵敏电化学平台与机器学习（ML）的诊断工具，以推进sEV-miRNAs的临床应用。通过利用多功能DNA纳米花，其作为空间限制结构加速局部CHA动力学并负载信号分子，从而实现了阿摩尔级别的灵敏度，并具有良好的特异性和稳定性。此外，临床队列（n = 68）中多种sEV-miRNAs的电化学信号……**CRediT作者贡献声明****李梓华：** 撰写—审阅与编辑、资金获取、概念化。**严丽芝：** 撰写—审阅与编辑、方法学、概念化。**朱怡平：** 可视化、资源、调查。**林智轩：** 可视化、资源、调查。**张烨：** 撰写—审阅与编辑、概念化。**杨超：** 可视化、软件、数据管理。**张晓合：** 撰写—原稿、验证、方法学、概念化。**严晓辉：** 撰写—审阅与编辑，**利益冲突**作者声明他们没有与本研究相关的财务/商业利益冲突。**利益冲突声明**√ 作者声明他们没有已知可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。作者声明他们没有已知可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。**致谢**本研究获得以下资助：非传染性慢性疾病—国家重点研发计划（2026ZD0557403）、广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515011918）、广东省医学科技基金（B2025346）、南方医院南方医科大学李梓华研究基金（2023B047）以及南方医科大学大学生创新创业训练计划。张晓合 | 潘杰振 | 林元红 | 林智轩 | 朱怡平 | 杨超 | 张烨 | 严丽芝 | 李梓华 | 严晓辉