基于荧光分子印迹纳米颗粒的纸传感器用于金黄色葡萄球菌的快速检测

《Talanta》：Fluorescent Molecularly Imprinted Nanoparticles-Based Paper Sensor for Rapid Detection of Staphylococcus aureus

　　

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  构建了基于FMIP的纸质传感器，用于快速检测金黄色葡萄球菌。
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  该纸质传感器可在5分钟内特异性识别目标细菌。
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  该纸质传感器可准确测定实际样品中的金黄色葡萄球菌。

引言

由金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠埃希菌O157:H7、沙门氏菌和志贺氏菌等致病细菌引起的食源性疾病持续威胁着食品安全，并已成为全球公认的、代价高昂的公共卫生问题[1]。这些食源性致病细菌可引发多种严重甚至致命的疾病[2]。其中，金黄色葡萄球菌是一种兼性厌氧的、不产生芽孢的革兰氏阳性菌，也是临床实践中常见的动物源性病原体之一[3]。该细菌可产生多种毒素，引起食物中毒、皮肤感染，甚至严重的系统性感染。由于其广泛存在于食品、医疗和环境领域，快速、灵敏地检测金黄色葡萄球菌对于保障食品安全和公共卫生具有重要意义。

目前，致病细菌的检测方法包括传统培养法[4]、免疫学检测法[5]和分子生物学技术[6]。在传统细菌检测中，平板计数法通常需要经过较长的培养期才能获得结果[7]、[8]，难以满足现代检测系统对时效性的需求[9]。免疫学方法依赖于生物抗体的特异性结合[10]，包括酶联免疫吸附测定[11]、免疫荧光测定[12]、[13]和胶体金免疫层析法[14]。这些方法因其兼容高通量和便携式快速检测平台，尤其是利用胶体金纳米颗粒的方法，受到了广泛关注。然而，所有免疫学检测均依赖于生物抗体，其制备不仅复杂且成本高昂，还存在批次间重复性差的问题[15]。分子生物学方法通过选择性扩增目标基因序列来实现细菌检测[16]，包括环介导等温扩增法[17]、[18]、[19]、聚合酶链反应技术、微阵列技术[20]、[21]以及基于CRISPR-Cas的检测系统[22]。尽管分子生物学技术快速且灵敏度高，但需要耗时的前处理步骤来提取样品中的特征核酸。例如，聚合酶链反应技术要求长时间的提取程序以获得特征性、稳定性和高质量的DNA序列，而提取不充分或DNA质量欠佳则可能导致扩增失败或假阴性结果。

分子印迹聚合物（MIPs）作为合成高分子受体和抗体，具有制备简单、成本低廉、稳定性高、易于运输和储存以及可重复使用等优点[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。大量研究已成功实现了多种模板分子的印迹[28]、[29]——包括金属离子、小分子、蛋白质和细胞——并将MIPs应用于分离[30]、传感[31]、成像[24]、药物递送[32]和治疗[33]。近年来，已报道了多种针对细菌的基于MIP的传感系统，包括用于检测沙门氏菌的丝网印刷电极平台、修饰细菌印迹聚吡咯薄膜的电化学阻抗传感器以及结合聚集诱导发光纳米材料的荧光印迹传感策略[34]、[35]、[36]。此外，基于硼酸亲和力分子印迹策略，我们此前开发了两种基于荧光人工受体的大肠埃希菌O157:H7传感器，并进一步在三维光子微球表面构建了微阵列平台，实现了对多种食源性致病细菌的多重检测[37]、[38]。然而，现有的细菌MIP传感研究仍主要集中在电化学传感、阻抗检测或常规荧光生物传感平台，将其集成到便携式低成本平台以实现快速现场检测的研究仍相对有限。

纸质传感器具有以下优势：柔软多孔的结构、便携性、低成本、样品消耗量少以及适合现场快速检测，使其在资源受限条件下用于致病细菌检测具有高度前景[39]、[40]。然而，纸质传感器的功能化目前主要依赖于物理吸附或简单的浸涂修饰。这些方法通常存在固定化稳定性不足、功能层分布不均匀以及识别位点可控性差等问题，可能会影响检测结果的重复性、选择性和实际可靠性。因此，在纸质基底上开发稳健且可控的识别界面，对于提高纸质细菌传感的选择性和可靠性仍至关重要。

基于上述研究基础和现有技术挑战，本研究将细菌表面分子印迹技术与荧光纸质传感平台相结合，构建了用于特异性识别和检测金黄色葡萄球菌的荧光MIP纸质传感器（方案1）。通过将具有特异性识别能力的荧光分子印迹识别单元引入纸质界面，该策略有望增强对目标细菌的选择性捕获，并提高界面功能化的稳定性。同时，该方法结合了MIP材料的高选择性、纸质平台的低成本便携性以及荧光检测的直观灵敏响应。与主要依赖电化学或常规荧光生物传感平台的现有细菌MIP传感系统相比，本研究在纸质传感平台上建立了金黄色葡萄球菌特异性的荧光分子印迹识别界面，为食源性致病细菌的快速、低成本、可视化的现场检测提供了一种新策略。

章节摘录

材料与试剂

异硫氰酸荧光素（FITC，97%）、正硅酸乙酯（TEOS，98%）、戊二醛（50%）和氰基硼氢化钠（95%）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，98%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希菌O157:H7（CICC21530）、大肠埃希菌（ATCC25922）、荧光假单胞菌（ATCC13525）、植物乳杆菌

纸质传感器的表征

从扫描电子显微镜（SEM）图像（图1a-1b）中可以清晰观察到裸纸、醛基功能化纸、FMIP@P和FNIP@P的表面形貌和结构差异。裸纸呈现典型的纤维网络结构，纤维排列疏松，表面相对光滑；经过对裸纸的化学修饰后，醛基功能化纸的纤维结构未发生显著变化（图1b）。相比之下，FMIP@P和FNIP@P的表面

结论

本研究通过将荧光分子印迹纳米颗粒共价组装到纤维素滤纸表面，成功制备了一种靶向金黄色葡萄球菌的荧光纸质传感器。基于FMIP的纸质传感器可在5分钟内特异性识别金黄色葡萄球菌，检测限低至77 CFU/mL。此外，该纸质传感器可准确测定实际样品中掺入的金黄色葡萄球菌，回收率在87%至116%之间。然而，相对较

CRediT作者贡献声明

周继红：撰写——审阅与编辑。李千进：撰写——审阅与编辑、监督、资金支持、概念构思。李睿：数据整理。王梦迪：调查研究、数据整理。郭巧：撰写——原稿撰写、数据整理。熊素芳：撰写——原稿撰写、数据整理。郭华：撰写——审阅与编辑、资金支持

利益冲突声明

作者声明，不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的经济利益冲突或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明，不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的经济利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到贵州省卫生健康委员会重点学科发展项目、西南区域重点和优势学科项目以及生命分析化学国家重点实验室（SKLACLS2508）的资助。

熊素芳|郭巧|王梦迪|李睿|李千进|周继红|郭华