湖河生态型三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）中可变剪接与基因表达呈现不同的转录组分化模式

《Canadian Journal of Zoology》：Alternative splicing and gene expression exhibit distinct patterns of transcriptomic differentiation between lake and stream ecotypes in threespine sticklebacks

三刺鱼（Gasterosteus aculeatus Linnaeus, 1758）在探讨平行适应性进化问题中发挥了重要作用，包括通过邻域分布湖河生态型之间表型分化的经典研究。尽管这些生态型之间的基因表达差异已有记录，但生态型之间可变剪接（alternative splicing, AS）分化的程度仍不明确。研究人员利用先前发表的脾和头肾RNA-seq数据，在来自太平洋和北大西洋的四个重复湖河生态型对中研究了这两种调控机制。研究人员鉴定出一小部分在生态型之间表现剪接分化的基因，而表达分化则广泛存在。差异剪接基因（differentially spliced genes, DSGs）与差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）在很大程度上不同，且功能组成相异。表达和剪接均表现出强组织特异性和有限的全局平行性。与海洋—淡水系统中报道的模式相反，差异剪接和差异表达基因在基因组分化区域中呈低代表性。最后，研究人员发现转录分化的推断对参考基因组选择具有稳健性，显著分化基因具有高一致性。总之，研究结果表明，基因表达和可变剪接在很大程度上代表湖河三刺鱼生态型之间转录组分化的独立层次，强调整合这两种调控过程以表征生态型间转录变异的重要性。

基因调控变异长期被认为是表型多样性的重要驱动因素。基因表达变化常被视为调控进化的主要转录机制；可变剪接（alternative splicing, AS）通过不同外显子组合从同一基因产生不同转录本异构体，提供互补且可观的转录多样性。二者可改变蛋白丰度、结构和功能，从而贡献表型变异。尽管越来越多证据表明差异基因表达和AS均贡献生态型适应性分化，但其相对重要性和关系仍不清楚。已有比较分化生态型的研究报道DEGs和DSGs重叠有限，提示二者作用于 largely distinct 的基因和调控通路。由于AS可在不改变整体表达水平的情况下多样化蛋白结构和功能，其被认为是潜在重要但尚未被充分探索的适应进化机制。三刺鱼从海洋反复快速适应多种淡水栖息地，产生多个生态型，是研究表达和AS相对贡献的优秀系统。其表型分化由小规模突变到大结构变异等多种遗传变化驱动，调控区差异贡献不成比例。许多研究调查了生态型间表达差异，揭示不同程度的平行性。AS也贡献三刺鱼表型变异，例如巢建构 spiggin 基因及 MSX2A 转录因子的替代5′剪接位点。近期海洋—淡水全转录组研究提示AS更广泛贡献适应分化，Eda单倍型下游存在差异AS基因，太平洋和北大西洋间弱平行剪接，海洋—淡水DSGs富集于高遗传分化和性状分化数量性状位点。海洋—淡水研究还显示DEGs与DSGs largely distinct。然而，湖河生态型这种广泛生态分化中AS是否类似贡献尚不明确。湖河生态型在形态和生理上重复进化差异，包括觅食和免疫功能相关性状；湖河种群在寄生虫负载、免疫能力、主要组织相容性复合体多样性及免疫基因表达方面不同，因此免疫组织适合研究转录分化。研究人员评估四个邻域湖河种群对，来自太平洋和北大西洋，使用先前发表脾和头肾RNA-seq数据。研究目标为：(1)评估独立湖河对中差异剪接程度和平行性；(2)测试DSGs是否与DEGs重叠；(3)确定参考基因组版本对转录分化推断影响。研究结果表明，基因表达和AS在很大程度上代表湖河三刺鱼生态型间转录组分化的独立层次，强调整合两种调控过程以表征生态型间转录变异的重要性。

为开展研究，研究人员使用先前发表数据集（ENA研究编号 PRJEB8677），包含77个野生三刺鱼全转录组文库，取自脾和头肾。四个湖河种群对为德国G1和G2、挪威No、加拿大Ca，跨北大西洋和太平洋，基因组平均F_ST（群体间遗传分化指数）为0.10–0.28。RNA-seq reads 经 fastp 质控，STAR 比对到 v5 和 v1 参考基因组，featureCounts 定量。DEGs 用 DESeq2，阈值 FDR（false discovery rate，错误发现率）< 0.05 和 |log₂ fold change| > 0.5。AS 和差异剪接用 rMATS，分类五类事件，基于 FDR < 0.05、|ΔPSI| > 0.10 且至少一个个体五个 reads 支持。用置换检验评估共享基因，Fisher精确检验评估富集，进行GO（Gene Ontology，基因本体）/KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和GO Slim分布比较，并比较 v1/v5 参考基因组影响。

结果部分保留原文三个小标题。第一，湖河生态型间可变剪接分化平行性较低。通过四个湖河对两种组织比较，14,280个蛋白编码基因表达，5,464个在至少一对至少一种组织发生AS。鉴定195个差异剪接事件对应142个DSGs，81%为skipped exons。65个DSGs仅头肾，52仅脾，25两组织。DEGs远多，为2032个，1073仅头肾，674仅脾，285两组织。最分化种群对Ca的DSGs和DEGs最多。合并四对，25个DSGs（18%）和222个DEGs（10%）在两组织均检出。无基因在四对均共享。18个DSGs（13%）至少在两个对共享，超过随机（置换检验 p < 1e-4）；14/18同ΔPSI方向，10/18同组织。DEGs中190个（9%）在超过一个对，超过随机 p < 1e-4；118个一致方向，80个同组织。与基因组分化区域比较，1117个表达基因被识别为序列分化outlier，仅9个DSGs（6%）和62个DEGs（3%）在各自对比，低于随机 p < 0.001。474个拷贝数变异（copy number variation, CNVs）中，6个DSGs（p = 0.478），112个DEGs（p = 3.123e-08），DEGs高于随机；10个表达CNV outliers中4个DEGs。与海洋—淡水鳃AS比较，3个DSGs共享：ankyrin 3a、ring finger and FYVE-like domain containing E3 ubiquitin protein ligase、methionine sulfoxide reductase B3；均有skipped exons但涉及不同外显子。

第二，差异剪接与差异表达涉及不同基因。比较142个DSGs与2032个DEGs，仅12个在同一组织和种群对比中同时为DSG和DEG，少于随机（Fisher exact，odds ratio < 1，p = 3.714e-15）。最差异剪接和表达基因在种群间不共享。DSGs无GO term富集，两组织分开或合并均无。DEGs富集蛋白水解、电子传递链、丝氨酸型内肽酶活性。eggNOG-mapper注释后，DEGs许多额外功能类别显著富集，DSGs仅细胞组分“cytoplasm”富集。GO Slim类别比例DSGs与DEGs显著不同（χ² = 261.85，Monte Carlo p = 2e-06，1,000,000重复）；DSGs缺失“translation”和“carbohydrate metabolic process”等DEGs最常见类别。GO Slim比例在组织间对DSGs（χ² = 121.36，p = 3e-06）和DEGs（χ² = 726.44，p < 1e-06）也显著不同。22个DSGs注释“immune system process”，但KEGG通路无显著富集；DEGs富集免疫识别和信号、线粒体能量代谢、蛋白合成。

第三，不同参考基因组得到相似但不完全相同结果。v1与v5比较，尽管仅33个基因不共享，v1有18,409个表达和6,590个剪接基因，v5有14,280个表达和5,464个剪接。v1检测更多总DSGs（169 vs. 142）和DEGs（2627 vs. 2032）。v5中96%（136）DSGs和96%（1946）DEGs也在v1发现。v5有而v1无的DSGs/DEGs是因基因落在统计显著性阈值两侧，而非v1缺失。表明转录分化推断对参考基因组选择稳健，但参考偏差仍影响基因检测分辨率。

讨论部分认为，AS和表达常通过 distinct 基因和通路作用。使用两个免疫组织，研究人员识别湖河生态型AS差异。多数剪接事件组织特异，DSGs比DEGs少约五倍，类似海洋—淡水和其他物种。但本研究DSGs以skipped exons为主，海洋—淡水研究使用相同rMATS但组织不同，以mutually exclusive exons最常见；这可能是生态型对比或组织生物学差异，需进一步研究。DSGs largely different from DEGs，与海洋—淡水、鲑科、向日葵、小鼠一致，提示解耦；AS常由trans-acting splicing factors介导，表达适应分化更多由cis-regulatory变异调节。DSGs无显著功能富集，类似海洋—淡水；功能类别比例与DEGs不同。82% DSGs和90% DEGs组织特异；头肾和脾功能注释不同：头肾中transferase activity和catalytic activity的DSGs比例至少两倍，以及RNA binding、mRNA metabolism、ribosome biogenesis的DEGs；脾中细胞分化、细胞运动、解剖结构发育的DSGs，以及carbohydrate metabolism的DEGs。这强调多组织采样的重要性。湖河系统表达平行性存在变异；本研究AS和表达全局平行性有限。重叠超过随机但无基因四对共享。与海洋—淡水AS弱平行类似。但不同于海洋—淡水DSGs常与分化区域共定位，本研究DSGs和DEGs在高度分化基因组区域低代表，提示可能更多反映可塑反应或trans-acting调控变异，而非与分化区域相关的cis调控。DEGs在CNVs富集，尤其高度分化CNVs，支持基因重复贡献湖河表达变异。参考基因组比较显示v1恢复更多表达和剪接基因，但DEG/DSG数量和身份高度一致，>95% v5也v1，推断稳健；参考偏差仍影响分辨率，尤其大西洋样本比对太平洋参考，泛基因组图和长读长RNA-seq可能改善检测、分辨率和可重复性。研究结论翻译：总之，研究结果表明，基因表达和可变剪接在很大程度上代表湖河三刺鱼生态型之间转录组分化的独立层次，强调整合两种调控过程以表征生态型间转录变异的重要性。