《Journal of Orthopaedic Research》：Extracellular Vesicles Are Associated With Biological, Mechanical, and Structural Tendon Healing Metrics in Preclinical Models: A Systematic Review and Meta-Analysis
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肌腱病（tendinopathies）占肌肉骨骼损伤的一半，但医学治疗仍缺乏。骨科生物制剂（orthobiologics）是为解决这一空白而开发的新型治疗手段，其中细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是有前景的方向。然而，目前对
肌腱病（tendinopathies）占肌肉骨骼损伤的一半，但医学治疗仍缺乏。骨科生物制剂（orthobiologics）是为解决这一空白而开发的新型治疗手段，其中细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是有前景的方向。然而，目前对EVs如何影响再生，包括内源性作用及作为促进肌腱愈合的工具，尚缺乏完整理解。因此，本综述的目的是汇总聚焦于使用动物模型理解EV治疗对肌腱愈合影响的文献。研究人员按照系统评价与Meta分析首选报告项目（PRISMA）报告指南进行文献检索。标题、摘要和全文筛选由两位作者完成。研究人员使用动物研究：体内实验报告（ARRIVE）、细胞外囊泡研究最低信息（MISEV）和实验动物系统评价中心（SYRCLE）指南评估透明度和偏倚风险，并对重叠的结局变量进行Meta分析。筛选后纳入46篇文章。大多数研究使用年轻雄性跟腱，EV细胞来源、损伤类型、给药方案和生物材料多样。若干ARRIVE（如盲法）和MISEV（如接种密度）建议在该文献中报告不佳，且按SYRCLE指南的偏倚风险相对较高。尽管异质性高，EV治疗与组织学肌腱愈合评分改善以及失效载荷、肌腱刚度和杨氏模量（Young's modulus）增加相关。进一步的Meta分析显示，EV治疗与I型胶原蛋白（type I collagen）和III型胶原转录（type III collagen transcript）表达增加，以及IL-6蛋白表达和衰老标志物降低相关。研究人员建议未来研究纳入不同年龄、性别，并更系统地制定EV递送方案。
临床意义声明（Statement of Clinical Significance）：本系统评价识别了肌腱和EV文献中的空白，同时揭示了EVs可能促进肌腱愈合的未探索机制。这种改进的理解以及对研究严谨性的呼吁，增强了EVs作为未来肌腱损伤治疗的转化潜力。
肌腱病（tendinopathies）约占肌肉骨骼损伤的一半，但针对肌腱病的医学治疗仍不足。急性肌腱断裂在美国的发生率约为3.80/100,000人年，60岁以上成人中约22%存在慢性肌腱撕裂。当前非手术治疗主要包括活动调整、物理治疗和抗炎药物，但10%–45%的肌腱病保守治疗失败；这些患者中29%–42%最终接受手术，再撕裂率可高达94%；选择非手术治疗者中35%–50%可能仍有慢性症状。因此，肌腱病理需要更有效的医学治疗。近二十年，富血小板血浆（platelet rich plasma, PRP）、骨髓抽吸浓缩物（bone marrow aspirate concentrate, BMAC）、微碎片脂肪组织（micro-fragmented adipose tissue, M-FAT）和胶原补片等骨科生物制剂（orthobiologics）逐渐用于临床，但其疗效难以确定，部分原因是研究设计异质、结局不一致和报告不完整。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是纳米至微米级膜性结构，含核酸、蛋白和脂质，几乎由所有细胞和组织分泌，可通过招募炎症细胞、调节驻留细胞表型、增加增殖和促进组织修复参与愈合；作为无细胞生物制剂，EVs具有低免疫原性、可能长期储存更稳定、可工程化以刺激细胞特异性反应等优势，可能支持个体化精准医学策略。然而，临床前研究中EV供体来源、分离与表征方法、给药剂量和频率、肌腱与损伤模型差异很大。过去5年虽有综述评估EVs对腱骨整合、跟腱愈合和肌腱免疫环境的影响，但聚焦EVs影响肌腱愈合的临床前系统评价有限，尚无Meta分析识别可能机制，报告透明度评估也有限。因此，研究人员旨在系统综述已发表文献，使用已发表指南量化报告透明度和偏倚风险，并Meta分析EV给药对体内动物模型肌腱损伤后愈合的影响。按2023年MISEV报告指南，研究人员将EVs定义为细胞自然释放、由脂双层界定且不能独立复制的颗粒，该总括术语包括外泌体、小EVs（<200 nm）、中/大EVs（>200 nm）和凋亡囊泡。
关键技术方法概括：研究人员遵循PRISMA、观察性研究Meta分析（MOOSE）清单、Cochrane干预系统评价手册和动物研究Meta分析实践指南；采用PECO框架，检索PubMed、Physiotherapy Evidence Database（PEDro）、EBSCO、Web of Science、Scopus和Cochrane Central Register of Controlled Trials，并由两位作者独立筛选标题、摘要和全文，随后进行引文检索。研究人员使用ARRIVE 2.0、MISEV和SYRCLE指南评估透明度与偏倚风险；将图形数据转为数值数据；采用DerSimonian-Laird随机效应模型计算标准化均数差（standardized mean differences, SMD），使用Cochran's Q评估异质性，并以SPSS Statistics 31进行统计。样本来源为数据库检索纳入的46项临床前动物研究，无人类队列。
研究结果：
3.1 EV来源、表征和体内损伤模型存在广泛变异。研究人员通过数据库检索获得344项独特研究，经标题、摘要和全文筛选后42项符合纳入，引文检索后新增4项，最终纳入46项。18项（39%）从大鼠细胞分离EVs；骨髓来源和脂肪干细胞最常见，分别为10项（22%）和11项（24%）。多数研究使用第3–5代细胞，16–21项（35%–46%），13项（27%）未报告细胞代次。30项（65%）使用年轻细胞来源，13项（28%）未报告细胞年龄；23项（50%）仅使用雄性细胞，16项（35%）未报告性别。CD63（24项，52%）、CD9（26项，57%）和TSG101（22项，48%）是最常用EV表征标志物，少数研究报告纯度标志物如ApoA1、ApoB。多数研究纳入直径100–300 nm的EVs（28–45项，61%–98%）。体内模型中，34项（74%）使用大鼠，42项（91%）使用年轻动物，41项（89%）仅使用雄性；跟腱损伤见于24项（52%）；29项（63%）采用全横断后手术修复，6项（13%）采用部分横断修复，12项（26%）采用胶原酶注射；31项（67%）在损伤后立即单次递送EVs；14项（30%）使用明胶支撑基质，4项（9%）使用胶原基质，15项（33%）未使用生物材料。该部分说明EV来源、表征、动物模型、损伤与递送方式差异显著。
3.2 排除标准、盲法、动物饲养细节和方案注册报告不足。研究人员使用ARRIVE指南评估报告质量，发现研究设计、结局指标、结果、背景、摘要、目标、伦理声明、解释、数据获取和利益冲突报告较充分；样本量、随机化、统计方法、实验动物、实验程序和推广/转化性报告不清；纳入/排除标准、盲法、动物饲养与管理、动物护理与监测、方案注册报告不足。所有纳入研究发表于2018年之后，报告透明度与发表时间之间无统计学显著关系。
3.3 若干EV特异性参数在文献中报告不足。研究人员使用2018年MISEV指南评估，发现多数论文适当报告培养基组成、产生细胞特征、培养温度、气体浓度、浓缩温度、EV直径分布和EV形态；但细胞接种密度、分子量截断、管类型、离心设置、EV中蛋白浓度和EV大小置信区间报告不佳。发表年份与对2018年MISEV指南的依从性之间无统计学显著关系。
3.4 该文献发表偏倚风险相对较高。按SYRCLE偏倚风险标准，序列生成是唯一持续报告的类别；基线特征、分配隐藏、随机饲养、干预和结局盲法、随机结局评估、不完整结局数据、选择性结局报告及其他偏倚来源均具有相对较高偏倚风险。发表年份与按SYRCLE量化的偏倚风险之间无统计学显著关系。
3.5 EV治疗与肌腱组织学评分和力学性能改善相关，尽管异质性高。Meta分析显示，与未接受EV治疗的肌腱相比，EV治疗与组织学评分改善相关；最大失效载荷、肌腱刚度和杨氏模量增加。尽管分析显示高异质性（I
2>90%），这些差异仍被检测到。研究人员尝试按人口学信息进行亚组分析以识别异质性来源，但未发现性别、物种、年龄、大小、细胞类型或代次、EV表征标志物、体内物种、性别、年龄、肌腱、模型、生物材料、损伤后时间或EV给药组织等变量具有显著效应。漏斗图未呈倒置金字塔对称分布，提示发表偏倚、小样本效应或其他研究间变异可能贡献高异质性。因组织学结局异质性高，研究人员进一步观察EV剂量与组织学效应量的关系，但统计效能不足，仅作可视化，未观察到明显模式。
3.6 EV治疗与肌腱I型胶原蛋白表达和III型胶原转录表达增加相关。Meta分析显示，EV治疗与I型胶原蛋白表达增加相关，但III型胶原蛋白表达未增加；转录表达呈相反结果，即EV治疗与III型胶原转录表达增加相关，而I型胶原转录表达未增加。研究人员还检测到EV治疗与IL-6蛋白表达降低和衰老标志物降低相关。漏斗图再次缺乏对称性，提示其他变异来源可能影响结果。由于高异质性，研究人员尝试解析潜在共同驱动因素，但未检测到显著交互。
讨论部分总结：本研究的目的是系统综述同行评议文献，以更好理解EVs对临床前动物模型肌腱愈合的影响。研究人员发现多数研究使用年轻雄性动物，但损伤部位和类型、EV给药方案和生物材料多样。排除标准和盲法等严谨性与可重复性特征，以及EV大小置信区间等EV报告指南内容，仍报告不佳；由于报告不足，该文献发表偏倚风险相对较高。尽管异质性高，Meta分析显示EV治疗与临床前模型肌腱愈合组织学评估和力学性能改善相关，包括失效载荷、肌腱刚度和杨氏模量增加；EV治疗还增加I型胶原蛋白和III型胶原转录表达，同时降低IL-6蛋白表达和衰老标志物。研究人员指出，肌腱再生受年龄和性别影响，EV对组织的作用也受来源细胞年龄和性别影响，但该文献较少考虑这些变量；绝经后女性肌腱损伤率高于绝经前女性和年龄匹配男性，且雌激素对肌腱力学性能有影响，因此建议未来研究整合年龄-by-性别范式。剂量和频率方面，少数研究给予多次EV剂量，无法定量评估其影响；其他器官系统研究支持多剂量策略，但本综述可视化未显示明显模式。关于I型和III型胶原，健康肌腱中约95%胶原为I型；III型胶原拉伸强度较低，损伤早期增加，最终被I型胶原替代，但该过程可能耗时数年。Meta分析未能辨别损伤状态与胶原转换的时间关系，两项研究虽同时检测I型和III型胶原转录与蛋白，但样本均在同一时间点采集，无法评估转录和蛋白相对变化。未来研究需理解胶原转录和蛋白表达在再生级联中的时序。EV给药还伴随力学性能和组织学愈合改善，提示增加胶原可能有益，但未来机制研究应考虑EVs对胶原羟化的影响，并使用二次谐波生成或电子显微镜评估新沉积胶原是否正向贡献于肌腱结构和功能。局限性包括：未前瞻注册；排除非英语和非同行评议研究；结果推广性限于年轻雄性肌腱；Meta分析数据仅由单作者提取；多数Meta分析异质性高；未使用Hedges' g和小样本校正；文献中33%未报告细胞性别、27%未报告细胞年龄；蛋白和转录Meta分析无法直接控制管家蛋白/基因使用；漏斗图不对称提示未发表研究可能影响偏倚；仅聚焦体内研究，而体外研究可分离特定细胞相互作用、信号通路和EV介导效应。
研究结论翻译：本综述的主要发现是，EV治疗可能有益于临床前模型中的肌腱愈合，表现为组织学结局、失效载荷、肌腱刚度和杨氏模量改善。可能促成这些改善的机制包括EVs增加I型胶原蛋白表达和III型胶原转录表达，同时降低IL-6蛋白表达和衰老标志物。大多数已发表研究使用年轻、雄性跟腱。进一步纳入老年和雌性动物将提高该文献的转化潜力。损伤类型、剂量方案和生物材料使用存在显著变异，未来研究应考虑系统测试这些变量的影响，以辨别其对EV有效性的作用。排除标准、盲法、动物饲养细节、方案注册、细胞接种密度、气体浓度、管类型和EV大小置信区间仍报告不佳，未来研究应特别关注这些结局变量更透明的报告。最终，这些发现支持进一步研究EVs对肌腱愈合的影响，并为EVs如何增强愈合提供见解。
