基于 MXene 的动态 DNA 逻辑电路调控 CRISPR-Cas12a 反式切割用于高通量 miRNA 检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Dynamic DNA logic circuits regulating CRISPR-Cas12a trans-cleavage on MXene for high-throughput miRNAs detection

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  计算机辅助设计的DNA电路被用于精确执行"AND"逻辑门以实现多路复用miRNA检测。
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  将CHA与CRISPR-Cas12a结合到MXene上实现了指数级双信号放大。
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  MXene作为优异的猝灭剂，通过大幅抑制背景噪声保证了超高灵敏度。
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  基于纸的微流控传感器被部署用于血清中miRNA的高通量测定。

引言

癌症的高发病率和死亡率仍然是严峻的挑战[1]、[2]、[3]。早期诊断是提高患者预后和生存率的关键因素[4]、[5]、[6]。微小RNA（miRNAs）是一类内源性、非编码的单链RNA分子。近年来，已被证明在包括肿瘤发生、增殖、转移和凋亡在内的生理过程中发挥关键的调控作用[7]、[8]、[9]、[10]。异常表达的miRNAs表现出高度的组织特异性和结构稳定性，使其成为癌症诊断中极具前景的生物标志物[11]、[12]、[13]、[14]。然而，早期癌症患者血清中的miRNAs以微量丰度和严重的背景干扰为特征[15]、[16]。由于单个miRNA在各种病理条件下存在表达重叠，多种miRNA的异常共表达可以更忠实地反映肿瘤生物学[17]、[18]。因此，开发用于检测低丰度靶miRNAs的高灵敏度、高特异性和高通量生物传感策略是一项重大挑战，这对于推进癌症早期诊断至关重要。

与定量实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）[19]相比，等温扩增消除了热循环和逆转录步骤。在确保灵敏度和特异性的同时，等温扩增大幅降低了时间和经济成本，因此展现出在临床即时检测中更大的潜力。催化发夹组装（CHA）是一种经典的等温扩增策略，发夹探针通过杂合化和toehold介导的链置换自发组装成核酸复合物[20]、[21]。在这一级联过程中，靶miRNA作为触发序列被持续置换和释放，实现靶标循环[22]。近年来，聚集规则间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）系统因其靶标识别和附带切割活性在分子诊断中展现了革命性潜力[23]、[24]。具体而言，CRISPR-Cas12a系统由CRISPR RNA（crRNA）和Cas12a核酸酶组成，当crRNA与靶核酸特异性结合时，Cas12a可被激活，释放其非特异性单链DNA（ssDNA）反式切割能力[25]、[26]、[27]。这种"单次识别，多次切割"级联为生物传感提供了高效的信号放大机制，大大提高了检测灵敏度[28]、[29]、[30]。CHA机制与CRISPR-Cas12a系统的偶联可将miRNAs转化为稳定的DNA激活剂。同时，靶标循环为Cas12a的反式切割提供了持续驱动力。

然而，用于临床miRNA检测的CRISPR-Cas系统仍面临局限性。传统的CRISPR-Cas传感范式遵循"一种crRNA-一种靶标"原则，难以实现多种核酸靶标的平行检测[31]、[32]、[33]。为突破这些瓶颈，动态DNA电路提供了一种有效的解决方案。DNA电路通过编程化的DNA杂合化和链置换处理靶标输入信号，生成可控的输出信号[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。DNA逻辑门通过DNA链相互作用执行逻辑运算，具有平行编码和执行算法的潜力[39]。与传统多路分析相比，基于逻辑门的生物传感器利用精确工程化的核酸相互作用和信息整合机制对多变量的信号进行逻辑处理，并将其转化为确定性的信号输出[40]。这不仅显著简化了信号处理，增强了诊断的准确性和可靠性，还为多重检测提供了一种有前景的策略。通过设计"AND"逻辑门，可以将多个生物分子输入整合到统一的信号输出中。具体来说，只有当两个靶miRNA严格共存时，下游反应才会被触发[41]。这种策略突破了单靶标检测的局限性。

等温扩增技术常用于驱动DNA逻辑电路[42]、[43]。值得注意的是，虽然将DNA电路与CRISPR-Cas系统偶联为低丰度、多靶标检测提供了理想策略，但这种级联网络显著增加了序列设计的复杂性。这种双重放大系统需要精确的工程化。一项任务是设计多组与不同靶标精确匹配的CHA发夹探针，另一项任务涉及工程化其他DNA电路组件以满足AND逻辑和crRNA特异性的要求。在均质环境中多种核酸分子共存容易产生非特异性杂合化、非期望的自组装和背景信号泄漏，这在多重检测系统中是致命的。为应对这一挑战，可以引入计算机辅助序列设计[44]、[45]。计算设计可以在巨大的序列空间中进行高效筛选，生成特异性序列。这些生成的序列满足热力学约束，并保证DNA电路的正确组装和CRISPR级联的激活[46]、[47]。计算编程的引入提高了设计精度，缩短了开发周期，降低了实验成本，为构建具有高鲁棒性、低背景噪声和卓越选择性的生物传感器奠定了基础。

本研究建立了一种基于纳米材料的新生物传感器，将动态DNA电路与CRISPR-Cas12a结合，用于血清中miRNAs的高通量和超灵敏检测。如图1所示，开发的Python程序可以输出DNA电路的相应序列。这些组件与MXene组装构建MXene支持的动态DNA电路。在该架构中，MXene作为ssDNA的固相载体和高效荧光猝灭剂[48]。通过金属配位、氢键和范德华力，MXene可以与生物分子（如DNA和酶）强烈相互作用。同时，其荧光猝灭能力抑制了背景信号[49]。这些特性使MXene成为构建高信背比生物传感器的理想候选材料[50]。该系统构建了严格的"AND"逻辑门：只有当两个靶标同时存在时，Cas12a才会被激活以实现荧光恢复。Cas12a、MXene和DNA电路的集成系统（称为CMC）实现了信号放大，提高了检测灵敏度。为扩展其实际应用性和临床转化潜力，CMC被集成为基于纸的微流控设备。通过同时操作三个独立设计的逻辑电路，该设备实现了对健康个体及乳腺、宫颈和肺癌患者血清样本中六个miRNA（成对组合）的平行分析。本工作为癌症早期诊断提供了有力的技术工具。

各章节摘要

材料与试剂

HPLC纯化的寡核苷酸序列（表S1）由海博生物科技（中国浙江）合成。10 bp DNA标记物购自赛默飞世尔科技（美国）。LbCas12a（Cpf1）核酸酶由拓元生物（中国上海）提供。miRNeasy血清/血浆试剂盒购自QIAGEN（德国）。miRNA第一链cDNA合成试剂盒和miRNA通用SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技。

CMC的作用机制

CHA反应作为集成DNA电路的核心动态引擎。如图1 A所示，靶标1和靶标2独立触发平行的CHA途径。靶标1启动发夹探针H1、H2和H3的自组装形成带有燃料序列（F1）的Y形复合物（H₁₂₃）。类似地，靶标2驱动H4、H5和H6组装成另一个带有F2序列的Y形复合物（H₄₅₆）。通过这一级联过程中的靶标循环，产生了大量的发夹结构。

结论

总之，我们成功开发了一种可程序化生物传感器CMC，将计算设计的动态DNA电路与基于MXene的CRISPR-Cas12a系统相结合。该系统能够同时识别双miRNA，有效克服了传统CRISPR-Cas检测固有的局限性。此外，CHA与Cas12a的偶联实现了信号放大，产生了卓越的灵敏度。为满足高通量临床筛查的需求，该

CRediT作者贡献声明

罗立强：撰写–审阅与编辑、监督、概念构思、资金获取、项目管理、资源提供。李媛媛：撰写–初稿、概念构思、项目管理、资源提供。陈慧男：撰写–初稿、调查研究。楼子轩：撰写–审阅与编辑、撰写–初稿、方法论、调查研究、概念构思。邓冬梅：撰写–审阅与编辑、概念构思、资金获取、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们不存在已知的竞争经济利益或个人关系，这些可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究受国家自然科学基金资助（编号：62171268和62571308）。

楼子轩|宋雨辰|邓冬梅|黄蓉|陈慧男|李媛媛|罗立强