GFH312通过抑制RIPK1介导的细胞凋亡与坏死性凋亡减轻缺血性卒中后神经元死亡

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：GFH312 Reduces Neuronal Death by Inhibiting RIPK1-Mediated Apoptosis and Necroptosis After Ischemic Stroke

摘要 目的： 探讨RIPK1抑制剂GFH312在缺血性卒中中的作用，并明确其潜在机制。 方法： 研究人员在成年小鼠缺血性卒中模型中给予GFH312。为确证治疗效果，开展了神经行为学测试及脑损伤评估。在缺血后不同时间点，采用免疫荧光、蛋白质印迹（Western blot）及实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测脑组织，以评估与细胞凋亡及坏死性凋亡相关的信号通路及炎症基因表达。 结果： 时间进程分析显示，缺血后坏死性凋亡与细胞凋亡被迅速激活，并于1–3天达到峰值。GFH312显著改善了卒中小鼠的神经功能并减轻了脑损伤。机制层面，GFH312通过抑制RIPK1相关信号通路（RIPK1-RIPK3-MLKL）显著抑制了细胞凋亡与坏死性凋亡。此外，GFH312还大幅降低了脑内炎症基因的表达。 结论： 细胞凋亡与坏死性凋亡主要发生于卒中后急性期。GFH312在缺血性卒中后发挥神经保护作用，该作用与其抑制RIPK1相关的细胞凋亡、坏死性凋亡及神经炎症有关。

论文解读：GFH312在缺血性卒中中的神经保护作用及其机制研究

一、研究背景与科学问题

缺血性卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，其病理机制涉及局部脑血流的暂时或永久性中断或减少。多种类型的细胞死亡及神经炎症已被证实是缺血性卒中发病机制中的重要因素。其中，受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）被确定为调控炎症信号通路、坏死性凋亡及细胞凋亡的关键介质。在缺血性卒中后的病理环境中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）介导的信号传导在早期激活RIPK1，而caspase抑制则促进RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）向RIPK1募集，形成淀粉样"坏死小体"复合物，最终诱导坏死性凋亡。在RIPK1依赖性凋亡（RDA）中，RIPK1与FADD及caspase-8组装信号复合物，进而激活下游caspase-3执行凋亡。此外，RIPK1通过促进TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-1α（IL-1α）等关键促炎细胞因子的产生和分泌，放大炎症反应。既往研究表明，抑制或敲低RIPK1可通过缩小梗死面积和促进卒中后神经功能恢复来保护缺血性脑损伤。

尽管RIPK1已被认定为极具潜力的治疗靶点，但针对RIPK1的药物研发仍处于早期阶段。多种RIPK1抑制剂已进入临床试验，但尚无药物获批用于临床，尤其是在缺血性卒中领域。GFH312是一种新型RIPK1抑制剂，也是中国首个获批进入临床试验的RIPK1药物，已在I/II期临床试验（NCT0467671和NCT05618691）中显示出良好的安全性和应用前景，但其在缺血性卒中中的治疗效果和机制尚未得到验证。因此，本研究旨在评估GFH312在缺血性卒中中的神经保护作用及其潜在机制。

二、研究设计与技术方法

研究人员构建了暂时性大脑中动脉闭塞（tMCAO）小鼠模型，采用成年ICR小鼠（25–30 g，6–8周龄，购自JSJ公司）。GFH312（纯度96.81%，溶解于0.5%羧甲基纤维素/0.2%吐温80，购自上海劲帆生物公司）在再灌注前15分钟经口服给药，剂量为10 mg/kg，此后每日两次，持续3天。主要技术方法包括：尼氏染色评估脑梗死及水肿体积；改良神经功能缺损评分（mNSS）进行神经行为学评估；免疫荧光标记检测凋亡神经元（NeuN/TUNEL双标）及TNF-α阳性细胞；蛋白质印迹检测凋亡及坏死性凋亡相关蛋白表达；实时荧光定量PCR检测炎症因子mRNA表达水平。

三、研究结果

3.1 tMCAO后细胞凋亡与坏死性凋亡的激活

研究人员在tMCAO后2、6、12小时及1、3、7天评估了细胞凋亡和坏死性凋亡的激活情况。免疫荧光染色显示，NeuN⁺/TUNEL⁺凋亡神经元比例从2小时开始逐渐增加，在1–3天达到平台期，7天时几乎无凋亡神经元。蛋白质印迹分析显示，坏死性凋亡相关蛋白RIPK1、RIPK3和MLKL在缺血损伤后上调，峰值表达出现在第3天。磷酸化蛋白中，P-MLKL在第3天显著升高，第7天下降。这些数据表明，卒中后凋亡和坏死性凋亡相关通路在不同程度上被激活，且随时间推移更加明显，最显著的变化发生在卒中后急性期，尤其是第3天。

3.2 GFH312减少脑梗死体积并促进神经行为恢复

基于实验设计，研究人员发现tMCAO后3天，GFH312显著减少了脑组织梗死体积和水肿体积。与组织学结果一致，GFH312治疗组小鼠在tMCAO后3天的mNSS评分显著降低，表明神经功能明显改善。此外，GFH312减轻了卒中后体重下降。这些结果表明，GFH312在卒中后急性期减轻了缺血小鼠的脑损伤并促进了恢复。

3.3 GFH312抑制神经元凋亡及坏死性凋亡相关通路

免疫荧光分析显示，载体组梗死周围区域有大量神经元发生凋亡，而GFH312治疗后NeuN⁺/TUNEL⁺凋亡神经元比例显著降低。蛋白质印迹结果显示，GFH312治疗后cleaved Caspase-3表达量及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值显著下调，表明凋亡激活受到抑制。在坏死性凋亡方面，与载体组相比，GFH312治疗显著降低了脑组织中MLKL、磷酸化RIPK1、磷酸化RIPK3和磷酸化MLKL的蛋白水平，而总RIPK1和RIPK3蛋白水平呈下降趋势但未达到统计学显著性。这些数据表明，GFH312作为RIPK1抑制剂，不仅减少神经元凋亡，还可能通过抑制RIPK1–RIPK3–MLKL介导的坏死性凋亡信号发挥神经保护作用。

3.4 GFH312抑制tMCAO后的神经炎症

免疫荧光标记显示，tMCAO后载体组动物脑内TNF-α⁺细胞显著增加，而GFH312治疗显著降低了TNF-α⁺细胞数量。RT-PCR结果显示，载体组动物脑内TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-17的mRNA表达量较假手术组显著升高，而GFH312治疗显著降低了这些炎症因子的表达。这些结果表明，GFH312显著减轻了tMCAO后的急性神经炎症反应。

四、讨论与结论

本研究系统观察了缺血性卒中后不同时间点细胞凋亡和坏死性凋亡的动态变化，并证实了RIPK1抑制剂GFH312在缺血性卒中中的有益作用及其潜在机制。研究发现，卒中发生后细胞凋亡和RIPK1依赖性坏死性凋亡迅速发生，并在急性期达到峰值。在卒中后急性期持续给予GFH312，对卒中小鼠发挥了神经保护作用，有效减轻脑损伤并改善神经行为表现。机制层面，GFH312通过抑制RIPK1减轻了脑组织中的神经元凋亡和坏死性凋亡严重程度，同时降低了多种神经炎症相关基因和蛋白的表达。

研究局限性包括：主要关注卒中后急性期，GFH312的长期效应有待进一步阐明；未采用RIPK1基因敲低/敲除或互补性药理学抑制剂进行靶点验证；分析主要在组织水平进行，GFH312对神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞等不同脑细胞类型的特异性作用有待进一步明确。

结论： 本研究证明新型RIPK1抑制剂GFH312在缺血性卒中后表现出显著的神经保护作用并改善卒中结局。进一步分析显示，GFH312能够抑制神经元凋亡、阻断RIPK1相关坏死性凋亡信号级联反应，并显著减轻急性神经炎症反应。研究结果表明，RIPK1可作为缺血性卒中的重要治疗靶点，GFH312有望成为一种同时调节细胞死亡和炎症反应的潜在干预疗法。