《Redox Biology》：Tyrosine nitration: An emerging mechanistic landscape in neurodegeneration and cardiopulmonary disease
蛋白质酪氨酸硝化是一种与氧化和炎症应激条件相关的翻译后修饰，由活性氧和活性氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, ROS和RNS）的产生驱动。这一修饰曾主要被视为氧化损伤的印记，现越来越多地被认识为一种选择性修饰，在特定生物学背景下可以改变蛋白质结构、稳定性、酶活性和相互作用网络。在机制上，硝化通过过氧亚硝酸盐依赖性和血红素过氧化物酶依赖性途径发生，并基于局部蛋白质结构、溶剂可及性和微环境化学优先靶向特定酪氨酸残基。
累积证据已在多种病理背景下识别出疾病特异性硝化特征。在神经退行性疾病中，包括阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化，tau、α-突触核蛋白、锰超氧化物歧化酶、ATP合酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、热休克蛋白和细胞骨架组分等蛋白质的硝化导致线粒体功能障碍、蛋白质聚集、代谢衰竭和神经元丢失。类似地，在心血管和肺部疾病中，蛋白质酪氨酸硝化通过修饰关键调节蛋白，损害内皮信号传导、纤维蛋白溶解、脂质代谢和屏障完整性，从而破坏血管和上皮稳态。
通过影响磷酸化依赖性信号传导、酶功能和蛋白质-蛋白质相互作用，酪氨酸硝化促成了氧化还原失衡与进行性细胞和组织功能障碍之间的联系。本综述总结了位点特异性蛋白质酪氨酸硝化的当前机制见解，突出了新出现的疾病相关硝化蛋白质组，并讨论了分析和结构方法的进展如何将硝化重新定义为一种功能性调节修饰。理解酪氨酸硝化的分子决定因素和后果可能有助于开发针对多种人类疾病的靶向诊断和治疗策略。
蛋白质酪氨酸硝化（protein tyrosine nitration）是一种由活性氧（reactive oxygen species, ROS）和活性氮（reactive nitrogen species, RNS）驱动的翻译后修饰。近年来，它已从氧化损伤的标志物转变为被视作具有功能后果的选择性修饰。尽管已知硝化与多种疾病相关，但其选择性机制、位点特异性决定因素以及作为治疗靶点的潜力仍缺乏系统整合。因此，这篇发表在《Redox Biology》上的综述旨在总结当前对位点特异性硝化的机制理解，汇总疾病相关硝化蛋白质组，并探讨技术进步如何将硝化重新定义为功能性调节修饰，以期为靶向诊断和治疗策略提供基础。该综述综合了三个十年来的基础研究和近期大规模蛋白质组学分析——包括一个包含908个硝化人类蛋白质和1971个独特硝化位点的数据库。
该综述采用了几项关键技术方法：质谱（mass spectrometry, MS）用于硝化位点的高通量鉴定，例如在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）脑组织、人类慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）和衰老骨骼肌中鉴定GAPDH的Y140/Y276/Y314/Y320等位点；遗传密码扩展（genetic code expansion, GCE）技术，通过琥珀抑制和正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对将3-硝基酪氨酸位点特异性地插入目标蛋白，用于评估单一硝化位点的功能；以及将纯化的位点特异性硝化蛋白（如Hsp90）递送至培养细胞，以模拟疾病组织中的生理占用水平。此外，屏蔽肽如NipR1和NipR2被用于在体内外选择性阻断RhoA Y34和Rac1 Y32的硝化。样本来源多样，包括人类AD脑组织、人类肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）脊髓、吸烟者血浆、人类动脉粥样硬化斑块及COPD肺组织等。
在神经退行性疾病部分：
4.1 阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）：
4.1.1 tau蛋白酪氨酸硝化对微管形成和聚集的影响：AD患者脑组织中的位点特异性免疫组化显示，Tau-nY18主要存在于胶质病理中，而Tau-nY29富集于神经元神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）中；体外硝化重组tau蛋白的研究表明，Y18、Y29、Y197和Y394的硝化损害微管结合能力并促进tau自聚集。
4.1.2 β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）酪氨酸硝化对聚集、毒性和突触功能障碍的影响：使用SIN-1体外硝化Aβ并确认Y10为唯一硝化位点的研究表明，Y10硝化稳定寡聚态Aβ，增强N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR）介导的兴奋性毒性，损害突触完整性。
4.1.3 ATP合酶α亚基酪氨酸硝化损害线粒体能量产生：通过MS在蛋白质组数据集中鉴定ATP5F1A的Y337/Y440为硝化位点；尽管未直接验证功能，但位点位于F1催化结构域，提示可能损害ATP产生，这与AD中的线粒体功能障碍相吻合。
4.1.4 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）酪氨酸硝化驱动代谢功能障碍和蛋白质聚集：人类AD海马中的氧化还原蛋白质组学鉴定GAPDH为硝化蛋白，且MS识别出Y140/Y276/Y314/Y320等位点，位于功能相关区域，提示可能影响催化活性和蛋白质相互作用。
4.1.5 酪氨酸硝化对热休克蛋白70（Hsp70）伴侣活性的影响：MS数据集鉴定Hsp70的Y336为硝化位点，位于底物结合域；在过氧亚硝酸盐处理的PC12细胞中，Hsp70是主要硝化蛋白之一，但递送硝化Hsp70并不诱导细胞死亡，提示其功能可能是丧失伴侣功能而非毒性获得。
4.1.6 锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）酪氨酸硝化影响线粒体抗氧化平衡：遗传密码扩展研究证实，Y34位点的硝化降低MnSOD酶活性并削弱抗氧化防御，这与AD中的线粒体功能障碍和氧化还原失衡相关。
4.2 肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）：
4.2.1 神经丝轻链多肽（neurofilament-light chain, NF-L）的酪氨酸硝化：在ALS脊髓中，硝化NF-L与氧化/硝化应激标志物共定位；体外过氧亚硝酸盐（peroxynitrite, ONOO
?）处理结合MS鉴定出Y17/Y138/Y177/Y265为硝化位点，并与神经丝组装减少相关；Y372位点由MS在细胞裂解物中鉴定，位于C端结构域，提示可能干扰丝状结构稳定。
4.2.2 热休克蛋白90（Hsp90）酪氨酸硝化及其功能后果：使用GCE和MS，研究人员鉴定Y33、Y56、Y276、Y484和Y596为硝化位点；Hsp90
NY56内源性存在于人ALS脊髓运动神经元和G93A小鼠模型中，激活嘌呤能受体P2X7导致钙内流和Fas依赖性凋亡；Hsp90
NY33则下调线粒体代谢而不诱导凋亡；结构研究表明Y33硝化导致二聚体去稳定和寡聚化，Y56硝化改变二聚体构象。
4.3 帕金森病（Parkinson's disease, PD）：
4.3.1 α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）的酪氨酸硝化：体外硝化研究表明Y39、Y125、Y133和Y136的硝化促进纤维化和毒性寡聚体形成；GLOD4被发现是一种锌依赖性“硝化酶”，能选择性催化过氧亚硝酸盐驱动的α-syn硝化，敲除GLOD4降低基础性和诱导性α-syn硝化，在小鼠纹状体和外周红细胞中得到验证。
4.3.2 酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的酪氨酸硝化及其在多巴胺丢失中的作用：MS鉴定TH的Y423/Y428/Y432为硝化位点，用苯丙氨酸置换后再经ONOO
?处理证实活性丧失，将硝化应激与多巴胺合成减少直接联系起来。
在心血管和肺部疾病部分：
5.1 心血管疾病：
5.1.1 纤维蛋白原酪氨酸硝化作为促血栓风险介质：从吸烟者和非吸烟者血浆中分离的硝化纤维蛋白原经MS鉴定出Bβ链Y292/Y422硝化位点；体外聚合实验显示，硝化导致血栓形成加速、纤维蛋白网络更致密和僵硬，且对纤溶酶介导的溶解更具抵抗力。
5.1.2 纤溶酶原和纤维蛋白原的酪氨酸硝化：纤溶酶原/纤溶酶的体内外研究显示，ONOO
?处理增加硝化并降低纤溶活性；吸烟者血浆中纤维蛋白原硝化水平升高，多个酪氨酸位点（如Aα、Bβ、γ链）被修饰，导致纤维蛋白聚合异常和促血栓状态。
5.1.3 载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I, ApoA-I）的酪氨酸硝化：使用基因编码硝基酪氨酸结合体外卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase, LCAT）活性实验发现，Y166硝化损害LCAT激活；髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）依赖性硝化研究显示，脂质结合状态下Y192的硝化对ATP结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1）介导的胆固醇外流影响甚微；从人动脉粥样硬化斑块中回收的ApoA-I中Y166是主要硝化位点。
5.1.4 低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）和ApoB-100的酪氨酸硝化：液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在体内修饰的LDL（LDL
?）中鉴定出Y276、Y666、Y720、Y2524、Y3139、Y3295、Y3489和Y4141等硝化位点；圆二色性分析表明α-螺旋丧失和β-折叠增加；巨噬细胞摄取实验证实通过LOX-1/CD36/SR-A清道夫受体的摄取增加，促进泡沫细胞形成。
5.1.5 环氧合酶-1（cyclooxygenase-1, COX-1）的酪氨酸硝化：纯化COX-1经ONOO
?处理后MS鉴定Y385为硝化位点，并伴随环氧合酶活性丧失；人动脉粥样硬化组织和ApoE
?/?小鼠主动脉病变中检测到COX硝化，且ApoE
?/?小鼠中的硝化依赖诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）。
5.1.6 肌浆网/内质网钙ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca
2+-ATPase, SERCA）的酪氨酸硝化：在衰老骨骼肌和心肌组织中，通过MS和抗双硝化肽抗体鉴定Y294/Y295硝化，并与SERCA活性降低相关，这导致钙再摄取减少、胞质钙升高和收缩功能障碍。
5.2 肺部疾病：
5.2.1 Ras同源家族成员A（Ras homolog family member A, RhoA）在酪氨酸34位的硝化驱动内皮功能障碍：在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）处理的人肺微血管内皮细胞（human lung microvascular endothelial cells, HLMVEC）中，MS鉴定Y34为单一硝化位点；结构分析显示硝化诱导鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）样构象变化，降低GDP结合亲和力；NipR1屏蔽肽阻断Y34硝化，体内外均可减轻内皮屏障破坏和肺部炎症。
5.2.2 Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1）在Y32位的硝化抑制：在LPS处理的HLMVEC中，MS鉴定Rac1 Y32硝化；在SIN-1处理的肺动脉内皮细胞（pulmonary arterial endothelial cells, PAEC）中亦观察到；硝化抑制Rac1活性，破坏内皮连接完整性，增加血管通透性；NipR2屏蔽肽在小鼠急性肺损伤（acute lung injury, ALI）模型中恢复Rac1活性并减轻肺泡损伤。
5.2.3 蛋白激酶G-1α（protein kinase G-1α, PKG-1α）硝化：在肺动脉高压（pulmonary hypertension, PH）动物和细胞模型中，MS鉴定PKG-1α的Y247/Y425为硝化位点；Y247F突变体在硝化应激下保留激酶活性，表明Y247是功能关键位点；硝化降低cGMP亲和力，削弱一氧化氮（nitric oxide, •NO）-可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase, sGC）-cGMP信号，导致磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A, PDE3A）活性升高、cAMP降低和内皮屏障脆弱性。
5.2.4 组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2, HDAC2）的氧化和硝化调节：A549细胞暴露于过氧亚硝酸盐、H
2O
2和香烟烟雾条件培养基后，MS鉴定HDAC2的Y68/Y73/Y146/Y167/Y173/Y253为硝化位点；Y253突变（替换为丙氨酸）减少蛋白酶体降解，而Y146硝化与活性下降相关；硝化HDAC2也存在于吸烟者和COPD患者肺组织中。
讨论部分指出，酪氨酸硝化不是随机的氧化应激副产物，而是靶向代谢、细胞骨架、氧化还原稳态和应激信号中关键调节蛋白的选择性过程。在神经退行性疾病中，硝化与蛋白错误折叠和聚集、线粒体功能障碍和神经元损伤相关；在心血管和肺部疾病中，硝化ApoA-I、RhoA、Rac1和PKG-1α破坏内皮信号传导、损害屏障完整性并驱动组织重塑。硝化与磷酸化等其他翻译后修饰的串扰增加了信号通路重编程的复杂性。方法学进展（如遗传密码扩展和位点特异性蛋白递送）使得在单残基分辨率下研究硝化成为可能，但目前仍依赖短期实验，体内持续表达系统尚待发展。
研究结论为：蛋白质酪氨酸硝化显示出疾病限制性模式、功能特异性和机制性影响，并在此基础上作为早期病理生物标志物和可行的治疗靶点具有相当大的前景。将该分辨率扩展到蛋白质组规模和体内模型是未来的主要挑战，需要将酪氨酸硝化视为更广泛氧化还原蛋白质组中的一个节点，与半胱氨酸氧化和其他氧化翻译后修饰以及相邻残基上的非氧化修饰（尤其是磷酸化）相结合进行解读。
