整合多组学方法解析植物对坏死营养型真菌病原体的防御机制

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Integrative multi-omics approaches to decipher plant defence mechanisms against necrotrophic fungal pathogens

　　

摘要

坏死型真菌病原体通过诱导宿主细胞死亡和广泛的代谢重编程，对全球农业构成重大威胁。要理解对这些病原体的抗性，需要将来自多个分子层面的生物信息进行整合，而非依赖单个防御组分。近年来，高通量组学技术（包括转录组学、蛋白质组学、代谢组学和脂质组学）的进展产生了大量分子数据集，用于研究植物与坏死型真菌的互作。本综述综合了来自整合多组学方法的最新证据，以解析植物抵御坏死型真菌的防御调控网络。我们考察了病原体识别、免疫信号通路、氧化还原信号及次级代谢（包括脂质来源信号分子的作用）之间的关系，并讨论了连接这些过程与抗性表型的基于网络的方法。此外，我们还讨论了新兴技术，如单细胞组学、空间组学、机器学习驱动的预测建模和基因编辑方法，以提高多组学候选衍生品的机制分辨率和功能验证水平。我们还指出了多组学数据集整合中的关键局限性，并提出了利用整合多组学策略开发对坏死型真菌病害持久抗性的优先方向。

1. 引言

坏死型真菌是一类复杂的病原体，其特征与宿主细胞死亡、组织软化和广泛的代谢重编程相关[1]。坏死型真菌感染通常伴随宿主活力、病原体生物量、激素信号传导、细胞壁完整性和代谢的动态变化[2]。因此，单一特征或分子层面不足以定义坏死型真菌的抗性机制。虽然传统的病害管理策略（包括作物轮作、间作、抗病品种和杀菌剂）旨在降低选择压力并提高病害防治策略的持久性，但其有效性受限于病原体活力、数量抗性、抗杀菌剂种群的发展以及日益加剧的环境问题[3]。

发展持久和可持续的抗性策略需要更深入地理解植物与坏死型真菌的互作，无论病害控制的进展如何。组学技术的最新发展为在多个分子水平上理解这些复杂关系提供了前所未有的机会[4]。通过利用基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表型组学的信息，研究人员可以全面了解植物的韧性机制。然而，单一的组学方法并不能提供足够的信息来理解植物在胁迫条件下反应的复杂性。因此，需要整合多组学方法，其中跨层数据整合可以全面揭示宿主-病原体互作期间的分子动力学[5]。这种整合性研究越来越多地有助于鉴定重要的调控网络和增强对坏死型真菌感染抗性的潜在靶标。然而，整合本身带来了与组学数据集、采样分辨率、网络干扰和验证相关的方法学挑战。此外，机器学习方法、单细胞组学和基因编辑技术的近期可用性，为连接多组学发现与功能验证及作物改良创造了新的机遇。

因此，本综述详细阐述了利用整合多组学方法阐明植物抗坏死型真菌感染防御机制的最新认识。在此，我们首先总结了宿主与坏死型真菌互作的生物学基础，随后考察了组学方法。我们讨论了整合多组学数据集以鉴定病原体和宿主特异性候选衍生品的策略。我们还考虑了新兴的机器学习、单细胞和空间方法，以及基因编辑技术在功能验证和转化应用中的结合。最后，我们也讨论了多组学数据整合中的方法学挑战，并提出了开发经实验验证的对坏死型真菌感染持久抗性模型的优先事项。

2. 宿主-坏死型真菌互作的生物学

坏死型真菌感染活体植物，其目标是在感染时或感染后不久杀死植物，并从死亡或垂死组织中获取营养。坏死型真菌分为宿主专化型坏死型真菌和广谱宿主范围型两类。具有广泛宿主范围的坏死型真菌产生植物毒性化合物、活性氧（ROS）、细胞壁降解酶（CWDEs）和诱导物，以在各种植物中传播感染。另一方面，宿主专化型坏死型真菌产生宿主专化毒素（HSTs），靶向易感宿主基因型。一个典型的例子是小麦专化病原体Parastagonospora nodorum（诺顿假单胞菌），它分泌坏死型效应子如SnToxA、SnTox1、SnTox3、SnTox5和SnTox267，与小麦易感基因（如Tsn1、Snn1和Snn3D1）相互作用，从而增强病害发展[6]。萌发后，坏死型真菌通过先前的感染位点或伤口位点被动穿透，通过气孔进入，或通过分生孢子座形成和酶解破坏等过程主动穿透[7]。成功穿透后，病原体定殖由裂解酶和增加的ROS水平促进，这些因子有助于宿主细胞瓦解和组织软化[8]（图1）。

图1. 坏死型真菌病原体感染周期及相应植物防御机制的示意图。感染过程包括孢子附着、萌发、分生孢子座形成、宿主穿透、细胞壁降解酶（CWDEs）分泌、宿主选择性毒素和活性氧（ROS）产生、组织定殖和产孢。代表性坏死型真菌利用CWDEs、毒素、ROS和效应蛋白促进感染。植物通过PAMP触发的免疫（PTI）和效应子触发的免疫（ETI）来对抗这些攻击，这些免疫反应由水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路介导，最终导致防御基因激活、病程相关（PR）蛋白产生、植物抗毒素合成、细胞壁加固以及其他抗微生物反应，从而限制病原体入侵。

像其他病原体一样，坏死型真菌也发展了产生效应子或致病因子以抑制PAMP触发的免疫（PTI）从而促进致病的方法（图1）。作为回应，宿主植物使用额外的受体即抗性（R）蛋白来识别病原体效应子并启动称为效应子触发的免疫（ETI）的免疫反应，这反过来导致植物中的HR（过敏性坏死）细胞死亡[9]。然而，宿主-病原体互作极其动态且具有进化性，因为病原体也可以通过获得新的效应子或使其效应子基因多样化来逃避ETI。坏死型真菌释放对宿主定殖和营养摄取至关重要的效应子，以建立成功的感染[10]。例如，诱导细胞死亡蛋白（CDIPs）是导致宿主细胞死亡的致病必需效应子群体。灰葡萄孢（B. cinerea）中BcGH61蛋白的缺失降低了真菌的致病性，减少了宿主细胞死亡和防御反应[11]。在另一项研究中，灰葡萄孢中BcXyr1调控分泌型PCWDEs（植物细胞壁降解酶）和真菌致病性。其缺失减少了分泌型CAZyme（碳水化合物活性酶）表达、致病性和ROS产生，而突变体的分泌组在烟草（Nicotiana benthamiana）中显示出较弱的细胞死亡诱导活性。一个BcXyr1调控的膨胀蛋白样蛋白也对致病性有贡献，凸显了CWDEs在组织软化和细胞死亡中的作用[12]。同样，坏死诱导蛋白（NIPs）、坏死和乙烯诱导蛋白（NEPs）和NEP样蛋白（NLPs）是坏死型真菌中常见的另一类蛋白。据报道，NLPs通过增加质膜（PM）通透性来促进病原体穿透[13]。类胡萝卜色孢菌（S. sclerotiorum）中类NEP1蛋白SsNEP2控制真菌ROS积累，从而增加致病性。产生的SsNLP24肽增加了抗抗假顶孢属（Hyaloperonospora arabidopsidis）的能力，并激活宿主MAPK信号传导和防御基因，表明SsNEP2既充当致病因子又充当PAMP[14]。此外，坏死型真菌释放宿主专化毒素（HSTs），触发R蛋白介导的ETI，导致HR细胞死亡和效应子触发的易感性（ETS）[10]。此外，ROS也由植物免疫反应通路产生，以应对生物营养型和坏死型真菌的攻击。坏死型真菌利用ROS触发的HR细胞入侵其宿主植物。然而，ROS由病原体和植物双方产生，使得难以确定其来源。在坏死型互作中，ROS成为一种疾病因子，并在超过特定阈值时导致细胞死亡。在感染期间，灰葡萄孢分泌转糖苷酶BcCrh4，该酶导致植物细胞死亡和PTI，以及胼胝质沉积和ROS积累[15]。

3. 宿主-坏死型真菌互作期间的激素交叉对话

植物激素是调节植物生长、发育和对环境刺激（包括病原体攻击）反应的低分子量信号分子。其中，水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）在调节介导对各种病原体基础抗性的信号网络中起核心作用[16]。JA和ET介导的信号通路对防御坏死型真菌至关重要，且这两种激素既独立又协同介导免疫反应[16]（图2）。抑制蛋白与ETHYLENE INSENSITIVE3（EIN3）和EIN3-LIKE1（EIL1）转录因子物理结合，在JA和ET通路之间提供协同作用。ET介导反应的主要调节因子是转录因子。JA-Ile（茉莉酰异亮氨酸）导致JAZ蛋白降解，释放EIN3和EIL1，后者需要ET来稳定。JA依赖的MYC转录因子（MYC2、MYC3、MYC4）和ET依赖的EIN3/EIL1是相互拮抗的代表，其物理接触控制JA/ET协调反应介导的拮抗反应以对抗坏死型病原体[17]。ERF和ORA59等下游转录因子在从JAZ抑制中释放后以及ET稳定的EIN3/EIL1作用下被正调控。这些因子随后与坏死型真菌应答基因的启动子相互作用，如植物防御素（PDF）。据报道，JA/ET依赖性防御基因PDF1.2a、PR-3和PR-4在拟南芥中过表达ERF家族成员（ERF96）时表达量增加。此外，与抗灰葡萄孢相关的拟南芥植物抗毒素camalexin。JA和ET协同作用刺激ERF1介导的camalexin生物合成以应对灰葡萄孢感染[18]。

图2. 植物与坏死型真菌互作期间激活的分子信号网络示意图。模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式（PAMPs/DAMPs），同时结合病原体衍生的效应子、毒素和细胞壁降解酶（CWDEs），启动PAMP触发的免疫（PTI）、活性氧（ROS）产生和Ca2+信号传导。这些信号激活MAPK级联反应、钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）以及关键的植物激素通路，包括茉莉酸（JA）、乙烯（ET）和水杨酸（SA），这些通路通过广泛的交叉对话相互作用，调节转录因子如WRKYs、ERFs、MYBs、MYC2、EIN3/EIL1和NPR1。这些调控模块的协同激活诱导负责病程相关（PR）蛋白、植物抗毒素生物合成、细胞壁加固、氧化爆发以及增强对坏死型真菌病原体抗性的防御基因。

相反，SA是一种影响植物生长和发育多个方面的酚类化合物。SA和JA控制的防御信号通路可能以协同或拮抗方式起作用（图2）。升高的CO2（eCO2）影响SA和JA的合成及其信号传导。据报道，eCO2通常促进SA生物合成和信号通路，同时抑制JA通路[19]。由于SA和JA信号传导的变化通常与病原体与宿主植物相互作用方式的变化相关，植物在eCO2条件下的防御反应因植物-病原体体系的不同而存在显著差异[20]。在升高的CO2条件下，观察到SA和JA通路之间的强烈拮抗。这表明SA介导抗性的激活可以抑制JA信号传导，从而增加植物对依赖JA依赖性防御机制的坏死型真菌的易感性。尽管如此，SA、JA和ET信号通路的相互作用使植物能够适应具有不同生活方式的病原体。由于这些通路之间的动态交叉对话，植物能够根据环境条件和病原体挑战平衡防御反应。

4. 真菌致病性的多组学表征

近年来的多组学表征阐明了坏死型真菌中致病性建立和维持的本质。病原体中心视角尤为重要，因为致病效应子的表达和分泌在非共生培养条件和宿主环境之间可能存在显著差异。分泌组分析已成为定义坏死型真菌在宿主感染期间使用的分子武器库的最信息丰富的方法。全基因组分泌组分析导致鉴定了候选效应子、CWDEs、CAZymes（碳水化合物活性酶）、蛋白酶和其他致病相关蛋白。最近，定量质谱的应用使分泌组分析能够更好地代表感染环境。例如，对灰葡萄孢感染番茄后的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析产生了3244个蛋白质，其中2045个在感染阶段间差异调控[21]。值得注意的是，分泌组分析主要与功能基因组学结合使用，而非限制性地进行分泌蛋白编目。在最近的一项研究中，类胡萝卜色孢菌（S. sclerotiorum）的分泌型效应子SsPEIE1通过与质膜定位的过敏性坏死反应蛋白（AtHIR4）相互作用来抑制宿主免疫反应，从而破坏PAMP诱导的ROS产生和SA诱导的防御[22]。坏死型真菌分泌组也超出了传统富含半胱氨酸效应子的范围。在最近的一项研究中，类胡萝卜色孢菌效应子SsCM1被证明通过靶向叶绿体MORF2蛋白来抑制植物免疫[23]。

尽管SsCM1缺乏典型香甲酰基丙二酸变位酶的酶活性，它仍能通过稳定MORF2并破坏叶绿体相关免疫反应来促进感染。类似地，真菌代谢组学在鉴定若干被腐生真菌用于抑制或重定向宿主防御的小分子代谢物方面发挥了重要作用。结合生物合成基因簇（BGC）的基因组挖掘、转录组分析和LC-MS/MS代谢组学，已鉴定出病原响应性代谢组学成分，包括宿主特异性毒素、真菌毒素、聚酮和非核糖体肽。采用一菌株多化合物（OSMAC）策略结合曲霉属（Fusarium verticillioides）的LC-MS/MS分析表明，真菌毒素的时间模式和相对丰度随基质条件的变化而变化[24]。这表明，通过整合代谢组学与BGC相关基因的转录组数据，可以更有效地鉴定控制毒素生物合成以感染宿主的条件特异性调控程序。腐生致病性还受植物和真菌双方活性氧（ROS）产生的调控。因此，真菌蛋白质组学和氧化还原蛋白质组学也有助于区分与病原相关的氧化过程与宿主来源的氧化反应。在灰葡萄孢（B. cinerea）中，bcnoxR突变体的氧化还原蛋白质组学分析鉴定出蛋白质巯基氧化的广泛变化，表明其参与维持真菌氧化还原平衡[25]。此外，利用高分辨率LC–MS/MS、非标记定量蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、氧化还原蛋白质组学和亚蛋白质组学方法，可以显著表征感染阶段特异性的真菌蛋白质组变化。时间蛋白质组分析显示，参与宿主侵入、细胞壁降解和真菌代谢的蛋白质经历广泛重编程，表明灰葡萄孢腐生致病性存在动态调控[21]。近期的一篇综述提供了通过日益增加的利用真菌分泌组学、表面活性组学、磷酸化蛋白质组学和细胞外囊泡蛋白质组学来对真菌感染机制进行多区室表征的大量信息[26]。

病原特异性的多组学方法还揭示，腐生真菌通过其效应子靶向质膜受体，并主动重编程MAPK组分、ROS生成系统、激素信号传导、叶绿体功能和代谢途径，而非简单地破坏宿主组织。例如，S. sclerotiorum的SsPEIE1通过改变AtHIR4寡聚化、减少PAMP诱导的ROS以及与水杨酸相关的防御反应来抑制宿主免疫[22]。此外，多组学研究表明，S. sclerotiorum效应子SsCm1靶向叶绿体RNA编辑因子MORF2，减少了胼胝质沉积、气孔关闭、乙烯产生、SA积累以及免疫标志基因的表达[23]。

早期高通量转录组学方法，包括基于芯片的谱系分析，为理解宿主对坏死型病原菌响应的复杂性提供了重要见解。对感染黄枝霉（Alternaria brassicicola）的甘蓝（Brassica oleracea）进行芯片分析显示，与激素代谢、谷胱甘肽-S-转移酶和次生代谢物相关的基因被广泛诱导，而光合相关过程则被下调[27]。真菌转录组学的一项重要延伸是双RNA测序，它从感染组织中同时捕获宿主和病原体的转录本。这使得可以在空间-时间条件下对两种生物的转录重编程进行协调分析，而这些条件从单独的宿主或病原体数据集中难以分辨。例如，对感染灰葡萄孢的拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行双RNA-seq分析，揭示了宿主和病原体均存在独特的转录变化，并检测到时间共调控的具有直接致病推进作用的真菌效应子群[28]。在另一个案例中，同时分析洋葱（Allium cepa）和辣椒根腐病番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cepae）的小RNA（sRNA）转录本表明，宿主miRNA抑制疾病易感因子，而Foc的sRNA通过跨物种RNA干扰调节致病性[29,30]。关联转录组学进一步阐明与疾病表型相关的宿主遗传变异和基因表达特征。在油菜（Brassica napus）中，该方法检测到抗性相关的表达标志物，其与感染的真菌病原体生活方式变化相关[31]。所有通过多组学方法获得的这些观察结果都支持一种模型，即腐生致病性是通过同步操纵多个宿主层次而非通过单一效应子或毒素产生的。这提供了从病原体角度出发的平衡框架，因此可以与宿主来源的组学数据集整合，以获得更完整的坏死型疾病发展的系统水平表征。

5. 解码宿主-坏死型病原体互作期间的转录组动力学

感染部位的转录谱分析提供了阐明坏死型感染过程中抗病和感病基因型动态分子反应的有效方法[32]。高灵敏度、准确性和提供全面转录组谱的能力使得RNA测序（RNA-Seq）技术成为植物抗病研究中广泛使用的技术[33]。通过转录组学方法对宿主-坏死型病原体互作进行深入的研究，促进了抗性相关基因和潜在防御机制的发现，如下节所述。

5.1. 丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）

真核生物利用高度保守的称为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联的信号通路来传递、整合和放大细胞信号（图3）。MAPK通路对于控制宿主-病原体互作和促进植物病原真菌的感染至关重要[34]。转录组研究表明，MAPK信号传导主要负责植物对坏死型真菌疾病的防御。当比较感染链格孢（A. alternata）的抗病和感病苹果品种时，发现抗病基因型表现出MAPK相关通路的增强激活，同时防御相关转录因子、抗性基因以及参与JA、ET和SA响应的激素信号传导组分表达增加[35]。类似地，感染紫斑菌（Macrophomina phaseolina）的大豆中MAPK信号传导显著升高，并作为关键调控枢纽协调WRKYs、抗氧化酶和与应激耐受和真菌抑制相关的病程相关（PR）蛋白[36]。感染立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的水稻的转录组分析突出了MAPKs在协调植物防御多个层次中的作用，显示MAPK级联与PRRs、Ca2+信号传导组分、WRKY TFs以及JA/ET响应通路被强烈激活[37]。CcSte11–CcSte7–CcPmk1级联控制黄花落叶松（Cytospora chrysosperma）的毒力和致病性，证明MAPK信号传导在宿主防御和病原体感染过程中具有保守的重要性[38]（表1）。总之，这些结果表明MAPK级联对于整合转录调控、激素信号传导和下游防御反应至关重要，从而提高对坏死型真菌感染的抗性。

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图3. 植物防御坏死型真菌病原体期间的整合代谢重编程。代谢组重编程涵盖中央碳代谢、氨基酸代谢、苯丙烷途径和次生代谢物生物合成的改变，这些改变赋予抗菌活性。同时，脂质组学分析揭示了广泛的膜脂质重塑和脂质衍生信号分子的积累，这些分子调控膜完整性、信号转导、程序性细胞死亡和防御基因激活。代谢物介导和脂质介导的信号之间的交互作用整合了涉及JA、SA、ET、钙（Ca2+）和ROS的植物激素通路，以协调有效的免疫反应。

表1. 通过多组学和基因组编辑方法在植物-坏死型病原体互作中鉴定的关键分子调控因子和防御机制。

| 组学层次 | 关键调控因子 | 植物 | 病原体 | 功能作用 | 引用 |
|---------|------------|------|-------|---------|------|
| 转录组学 | MAPK级联（如CcSte11–CcSte7–CcPmk1） | 本氏烟 | 黄花落叶松 | 协调宿主防御信号和真菌毒力 | [38] |
| 转录组学 | WRKY46/WRKY73 | 番茄 | 炭角菌 | 负调控因子；增加对坏死型病原体的易感性 | [39] |
| 蛋白质组学 | β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、TLPs | 大豆 | 紫斑菌 | 通过真菌细胞壁降解直接发挥抗真菌活性 | [36] |
| 磷酸化蛋白质组学 | SlFERL–SlMAP3K18 | 番茄 | 灰葡萄孢 | 激活MAPK级联以增强防御信号 | [40] |
| 代谢组学/脂质组学 | 烯联醇、OPDA、磷脂酸 | 拟南芥 | 灰葡萄孢 | 抗真菌植物抗毒素和脂质衍生防御信号 | [18] |
| 表观基因组学 | SDG8（H3K4甲基化） | 拟南芥 | 灰葡萄孢 | JA/ET响应基因激活（PDF1.2a, VSP2）所必需 | [41] |
| 网络/AI-ML | WGCNA枢纽基因（ABCG11, CCR1） | 玉米 | 多胞锈菌 | 细胞壁加固和防御化学物质运输 | [10] |
| 基因组编辑 | SlPUB21（CRISPR敲除） | 番茄 | 灰葡萄孢、链格孢 | 丧失易感因子赋予广谱抗性 | [42] |

5.2. WRKY

一系列WRKY转录因子协调防御基因表达、ROS稳态和激素信号传导，并作为对坏死型真菌感染抗性的正调控因子发挥作用（图3）。MAPK相关信号传导以及MdWRKY46和MdWRKY45的诱导有助于增强苹果的抗性[43]。类似地，芍药（Paeonia lactiflora）的PlWRKY65促进防御相关基因的表达，并维持SA和JA信号通路之间的平衡，以有利地控制对细链格孢的抗性[44]。其他正调控因子包括草莓中的FvWRKY50，通过激活JA响应防御基因来增强对坏死型病原体的抗性[45]。相反，某些WRKY TFs作为抗性负调控因子发挥作用。例如，番茄中的SlWRKY46通过抑制SA和JA介导的防御信号、抑制防御相关酶并破坏ROS稳态来增加对灰葡萄孢的易感性[46]。综上所述，WRKY TFs在植物对坏死型病原体的免疫应答中通过整合SA、JA和ET信号通路并根据病原体生活方式微调防御反应，在调控激素交互作用方面发挥着关键作用。

5.3. 病程相关蛋白

病程相关（PR）蛋白是由多基因家族编码的低分子量蛋白，主要在病原体攻击时表达。JA和ET通路的激活导致下游PR蛋白的积累并改变激素产生。最终，这些蛋白有效限制感染向未感染组织的系统性扩散并减轻病原体胁迫[47]。新兴的转录组学和功能研究表明，PR基因表达增强与对坏死型病原体抗性增加密切相关。例如，SA依赖的PR蛋白（PR1、PR2和PR5）有助于葡萄对灰葡萄孢的抗性，而在番茄感染指腐菌（Pythium aphanidermatum）期间PR1、PR2、PR3和PR5被显著诱导，通过细胞壁降解、膜破坏和甾醇隔离抑制真菌生长[48]。在三七（Panax notoginseng）中，对毁灭假壳贝（Ilyonectria destructans）的抗性由来自九个不同家族的152个PR基因促进，其中PR3、PR4和PR12在JA处理后显著诱导[49]。由NAC TFs协调调控的38个PR基因支持了强大的抗真菌防御系统，其中一些在感染期间被激活并表现出持续表达[49]。重组PnPR4对毁灭假壳贝表现出抗真菌作用，且在烟草中异位过表达显示抗性增强。此外，PnPR4过表达增加了烟草对尖孢镰刀菌的抗性，表明其在抗真菌防御中具有更广泛的功能。所有这些都表明PR蛋白是关键的下游防御元件，结合了直接抗真菌和抗菌活性与激素信号传导，以提高广谱抗病性。

6. 基于蛋白质组学的宿主-坏死型病原体互作功能探索

全基因组蛋白质组谱系分析表明，真菌感染触发了大量与抗真菌作用、ROS调控、细胞壁加固和次生代谢物形成相关的防御酶[50]。包括β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、类瘦素样蛋白和抗毒素在内的PR蛋白是最频繁诱导的蛋白。它们通过降解真菌细胞壁组分或作为抗菌剂直接阻止真菌生长。这些蛋白的积累已在大量坏死型病原体系中报告[51]（表1）。几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是最受关注的蛋白之一，它们水解真菌细胞壁中的几丁质和葡聚糖以削弱真菌结构并促进病原体死亡。类瘦素样蛋白（TLPs）也表现出直接抗真菌作用。例如，百脉根类瘦素样蛋白（MtTLP1–5）对根腐丝核菌、链格孢、禾谷镰刀菌、茄病镰刀菌、青霉属和疫霉菌属表现出强效抗真菌活性，降低真菌菌丝活力和链格孢孢子萌发[52]。总之，这些防御蛋白直接靶向真菌结构，提供第一道防线。蛋白质组学研究还强调了抗氧化和氧化还原调控酶在抗病中的重要性。在病原体诱导的氧化胁迫下维持细胞氧化还原平衡所必需的酶包括基质抗坏血酸过氧化物酶（SAPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物还原蛋白、硫氧还蛋白、肽蛋氨酸亚砜还原酶（PMSR）和乳酸酰谷胱甘肽裂解酶。它们的丰度增加保留了防御激活所需的ROS信号特性，同时防止ROS过度积累。此外，通过保持蛋白质稳定性和清除感染期间产生的受损蛋白，参与蛋白质质量控制和周转的蛋白质（如ClpC伴侣蛋白、FtsH蛋白酶和20S/26S蛋白酶体组分）支持应激适应[53]。虽然防御相关酶协同作用以增强免疫信号和广谱抗性，但苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化苯丙烷途径的入门步骤，为木质素、黄酮类化合物、植物抗毒素和其他酚类防御化合物提供前体[53]。SOD表达和活性增强与番茄-根腐丝核菌互作中过氧化氢（H2O2）和胼胝质积累增加以及病害严重程度降低相关，强调了受控ROS代谢在抗性中的重要性[54]。同样，番茄中SlNPR1的破坏通过提高谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、过氧化物酶（POD）和SOD活性，改变苯丙烷代谢和ROS稳态来增强对灰葡萄孢的抗性[55]。一致地，棒束棒束镰刀菌的细胞壁激发子通过诱导POD、PAL和PPO活性、促进木质素和酚类积累、降低氧化损伤来提高银杏的抗性，所有这些限制了叶斑病的发展[56]。

这些结果共同表明，防御相关酶通过将抗微生物代谢物的产生、细胞壁强化和活性氧（ROS）调节相结合，来增强植物对真菌感染的抗性。全蛋白质组学分析还鉴定出细胞壁相关酶是参与宿主防御的一类突出蛋白。果胶甲酯酶（PMEs）、多聚半乳糖醛酸酶、β-木糖苷酶4（BXL4）、枯草杆菌素酶（SBT3.3和SBT3.5）以及果胶甲酯酶抑制剂（PMEIs）均参与细胞壁的重塑和加固，从而限制病原体的入侵[57]。这些变化对于拟南芥防御灰葡萄孢菌尤其关键，涉及真菌细胞壁降解与植物细胞壁重塑之间的相互作用。蛋白质组学还表明，木质素化和次级代谢相关酶参与坏死性营养体感染。与苯丙烷途径相关的主要酶，包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酰连接酶（4CL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）和UDP-糖基转移酶，均参与类黄酮的形成、木质素沉积和抗微生物化合物的合成。这些途径增强了针对病原感染的化学防御，并改善了结构屏障。另一方面，在受冠锈菌侵染的鹰嘴豆中抑制PAL介导的木质素生物合成，以及在受立枯丝核菌侵染的棉花中减少木质素相关酶的积累，表明坏死性营养体介导了对宿主抗性的抑制[58]。除了结构防御外，蛋白质组学研究还揭示了参与植物抗毒素和十字花科硫苷生物合成的酶，如植物抗毒素缺陷3（PAD3）和细胞色素P450 81F2（CYP81F2），这些酶有助于产生限制坏死性营养体生长的抗微生物代谢物[59]。这些结果表明，防御相关酶通过整合直接抗真菌活性、氧化应激管理、细胞壁加固和次级代谢物形成，协同作用建立针对真菌病原体的多层防御机制。

6.1. 磷酸化蛋白质组学与信号转导

宿主-坏死性营养体感染期间的磷酸化蛋白质组学分析显示，蛋白质磷酸化对植物免疫信号转导具有重要贡献[60]。磷酸化蛋白质组学通过检测蛋白质磷酸化状态的变化，为了解与抗病性相关的受体、激酶、转录因子和下游信号组分的激活提供了洞察。磷酸化蛋白质组学研究发现了众多MAPK调控的蛋白质，这些蛋白质支持免疫反应。在拟南芥中，发现MPK6依赖的磷酸蛋白DEK2是防御和激素相关基因表达的重要调节因子，将MAMP检测与随后的免疫信号转导联系起来[61]。同样，在响应灰葡萄孢菌的毒力因子BcPG1时，受体样激酶SlFERL激活了MAPK级联组分SlMAP3K18，增强防御信号并维持免疫稳态[40]（表1）。在其他报道中，磷酸化与其他翻译后修饰之间的相互作用已被证明是广泛的。例如，在受灰葡萄孢菌侵染的月季中观察到免疫信号相关蛋白中磷酸化和泛素化的协调调控，表明多种翻译后修饰协同作用以优化防御反应[62]。同样，E3连接酶PUB13对番茄中的植物硫化物激酶受体1（PSKR1）介导的信号进行泛素化，说明在免疫过程中互连的翻译后修饰网络如何调控受体丰度和信号输出[63]。这些联系展示了磷酸化之外信号调控的复杂性。此外，磷酸化蛋白质组学还揭示了真菌感染改变宿主信号通路的方式。例如，真菌效应因子CfEC92通过重新编程苹果中RLK、CPK和MAPK的磷酸化来降低宿主抗性，从而激活MdNDPK2–MdMPK3信号通路[39]。在其他实验中，番茄的BRAK–PSKR1磷酸级联通过MAPKKK、RLK和CDPK整合免疫和发育信号[64]。总而言之，磷酸化蛋白质组学表明，磷酸化通过RLK、MAPK、CDPK、TF、膜相关蛋白和相互作用的翻译后修饰的协调活性，控制病原体感知、信号传递、防御基因表达和免疫稳态。

6.2. 氧化还原蛋白质组学与ROS相关蛋白

植物免疫反应主要由活性氧（ROS）和活性氮（RNS）调节，它们既作为抗微生物剂，又作为协调防御活性的信号介质。ROS信号转导主要通过氧化蛋白翻译后修饰（Oxi-PTMs）发生[65]。Oxi-PTMs作为分子开关，在病原感染期间精确控制蛋白质的结构、稳定性、电荷分布和分子间相互作用。因此，氧化还原依赖的蛋白质变化是将氧化爆发与随后防御反应联系起来的关键调控机制。氧化还原蛋白质组学的最新发展使得大规模鉴定氧化翻译后修饰和ROS响应蛋白成为可能。硫基组分析、活性蛋白质谱、化学蛋白质组学和半胱氨酸反应探针等方法，使得全蛋白质组范围内氧化还原敏感蛋白和氧化修饰的检测变得更容易[66]。这些方法展示了与免疫、胁迫耐性和病原体毒力相关的蛋白质受到广泛氧化还原调控的现象，并大大加深了我们对植物氧化还原组学的理解。此外，硫基化检测技术的进步使得对数千种蛋白质中氧化半胱氨酸残基进行高分辨率作图成为可能，为了解ROS介导的信号网络提供了重要洞察[67]。蛋白质组学和整合多组学研究还鉴定出多种在坏死性营养体攻击期间维持氧化还原平衡所必需的ROS相关蛋白。例如，对圭亚那刺豆的整合磷酸化蛋白质组学和质膜蛋白质组学分析表明，在抵抗炭疽病期间，通过协调激活ROS产生、ROS感知和抗氧化系统，免疫信号与氧化还原调节之间存在紧密联系[68]。氧化还原蛋白质组学还获得了关于真菌毒力的重要信息。NADPH氧化酶（NOX）复合物控制丝状真菌的生长、毒力和胁迫适应，是ROS的重要产生者。在灰葡萄孢菌中发现众多NOX依赖的氧化还原敏感蛋白，如NoxA、NoxB、BcNoxR、蛋白二硫键异构酶（PDI）、小GTP酶和NADH-泛醌氧化还原酶，参与代谢、信号、抗氧化防御、细胞骨架组织和蛋白质折叠。这些蛋白质对氧化还原稳态和毒力的贡献突显了ROS调节在宿主防御和真菌毒力通路中的重要性[25]。总体而言，氧化还原依赖的翻译后修饰通过修饰参与信号、转录、翻译、代谢、抗氧化防御和宿主-坏死性营养体通信的蛋白质，将氧化还原信号与下游防御反应整合起来。氧化还原蛋白质组学的发展仍在揭示这些调控网络的详细机制，为理解抗病性和创造更能抵抗生物胁迫的作物开辟了新可能性。

7. 通过代谢组学和脂质组学探索代谢重编程

代谢重编程是植物胁迫适应和生存的关键组成部分[69]。次级代谢物（SMs），包括生物碱、类黄酮、酚酸和色素，在宿主-坏死性营养体相互作用期间呈现可变诱导。这些物质进一步分为萜类、酚类、含氮化合物、含硫化合物和其他具有特定作用的专用代谢物，在宿主介导的针对坏死性营养体的防御中发挥特定作用[70]。近年来，整合代谢组学已被用于检测参与宿主-坏死性营养体相互作用的一种或多种SMs。萜类是植物SMs中最大的一类，在气孔控制、信号、抗氧化活性和植物防御中具有直接作用。许多萜类展现出针对坏死性营养体感染的强抗真菌特性。例如，香荆芥酚能有效抑制引起多种水果和蔬菜腐烂的病原菌链格孢菌[71]。同样，源自冬青属植物的倍半萜类在对抗小麦条赤黑粉菌方面表现出强活性，而紫苏醛则能有效抑制灰葡萄孢菌[72]（表2）。同样，许多酚类化合物增强植物防御并具有直接抗真菌作用。例如，葛根素通过引起ROS积累和破坏真菌膜完整性来抑制菌核镰刀菌，而阿魏酸通过促进防御酶和SA、JA、NO介导的信号转导来增强番茄对灰葡萄孢菌的抗性[73]。丁香酚和各种柑橘来源的类黄酮等酚类化合物通过抑制植物病原真菌的生长和毒素生物合成而展现广谱抗真菌特性[43]。类似地，生物碱也提供针对微生物病原体的重要保护。6-甲氧基-苯并噁唑-2-酮（MBOA）和苯并噁唑-2-酮（BOA）直接抑制假镰刀菌的生长和细胞分裂，从而增强小麦抗性[74]。

表2. 参与植物防御针对坏死性营养体真菌病原体的主要次级代谢物。

次级代谢物类别 | 代表性代谢物 | 防御中的主要生物学功能 | 代表性坏死性营养体病原菌 | 参考文献
萜类 | 紫苏醛、倍半萜、考莱克斯 | 抗真菌活性、抑制孢子萌发、破坏真菌膜、诱导防御信号 | 灰葡萄孢菌、小麦条赤黑粉菌、镰刀菌属 | [63]
酚酸 | 阿魏酸、咖啡酸、绿原酸 | ROS清除、木质素化、激活SA和JA介导的防御通路 | 灰葡萄孢菌、链格孢菌属 | [39]
类黄酮 | 槲皮素、山柰酚、柚皮素、柑橘类黄酮 | 抗氧化活性、抑制真菌生长、调控毒力基因 | 灰葡萄孢菌、链格孢菌 | [28]
植物抗毒素 | 芥子碱、萝卜硫素A、法卡林二醇 | 快速抗微生物防御、抑制真菌生长和定殖 | 芸薹链格孢菌、灰葡萄孢菌、菌核镰刀菌 | [18]
硫代葡萄糖苷 | 黑芥子苷、黑芥子苷、吲哚类硫代葡萄糖苷 | 水解产物具有强抗真菌活性；诱导防御信号 | 菌核镰刀菌、芸薹链格孢菌 | [75]
生物碱 | 苯并噁嗪类、BOA、MBOA | 抑制真菌生长、抑制菌丝发育和毒素产生 | 假镰刀菌 | [64]
鞣质 | 缩合鞣质、水解鞣质 | 细胞壁加固、蛋白质沉淀、抑制真菌酶 | 灰葡萄孢菌、菌核镰刀菌 | [40]
木质素前体（苯丙烷类） | 单木质素醇、松柏醇、芥子醇 | 细胞壁木质素化、限制病原体渗透 | 立枯丝核菌、冠锈菌、灰葡萄孢菌 | [36,47]
挥发性有机化合物（VOCs） | 己醛、己烯醛、单萜 | 直接抗真菌活性、诱导系统性防御反应 | 灰葡萄孢菌、链格孢菌属 | [63]

7.1. 植物免疫中的脂质类

脂质是植物防御的重要组成部分，在角质层和质膜中充当结构屏障，同时在植物-病原体相互作用中也作为信号分子发挥功能[75]。此外，脂质还作为关键的信号分子控制植物免疫反应。质谱（MS）、核磁共振（NMR）光谱、荧光光谱、双偏振干涉仪和计算方法等技术的快速发展，促进了参与植物免疫的细胞脂质通路和大规模网络的系统性研究[76]。尽管像JA这样的氧脂是植物中最为知名的脂质衍生信号，但其他脂质衍生物如12-氧-植物双烯酸（OPDA）也在调节针对坏死性营养体病原体的防御中发挥关键作用，通过促进防御相关基因的广泛转录重编程[76]。最近的基于组学的研究表明，LOX衍生的氧脂通过直接抗真菌活性和信号转导协调对坏死性营养体真菌的抗性[77]（表3）。此外，磷脂酸（PA）、磷脂、鞘脂、神经酰胺-1-磷酸（C1P）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和糖基肌醇磷酸神经酰胺（GIPC）衍生物已作为重要的脂质介质被发现，调节茉莉酸信号、ROS稳态、自噬、程序性细胞死亡和针对坏死性营养体的抗性[[78], [79], [80], [81], [82], [83]]（表3）。

表3. 参与植物防御针对坏死性营养体真菌病原体的主要脂质类分子。

脂质类别 | 分子 | 主要防御功能 | 代表性病原菌 | 参考文献
游离脂肪酸 | 亚油酸（18:2）；α-亚麻酸（18:3） | 膜重塑；抗微生物活性 | 灰葡萄孢菌；链格孢菌属 | [78]
氧脂 | JA；JA-Ile；MeJA和其他含氧脂肪酸 | 防御信号；JA依赖转录的调控；ROS调节；抗微生物活性 | 灰葡萄孢菌；芸薹链格孢菌；伏桂镰刀菌 | [77,79]
磷脂酸 | PLD/DGK途径产生的PA种类 | JA生物合成/信号；防御反应；ROS调节 | 灰葡萄孢菌 | [80]
溶血磷脂 | 溶血磷脂酰乙醇胺（LPE） | 诱导防御相关转录；增强JA信号和ROS稳态 | 灰葡萄孢菌；异孢蠕孢菌 | [81]
鞘脂 | 神经酰胺；鞘氨醇碱磷酸 | 程序性细胞死亡调控、ROS信号和免疫反应 | 菌核镰刀菌；链格孢菌属 | [78]
神经酰胺-1-磷酸 | C1P | 脂质信号；防御激活和调控病原体诱导的反应 | 菌核镰刀菌 | [82]
糖基肌醇磷酸神经酰胺 | GIPCs和GIPC衍生物 | 膜相关信号；宿主-病原体脂质相互作用 | 灰葡萄孢菌 | [83]
磷脂 | PC；PE；PG；PI；PS | 膜完整性；膜相关防御信号的调控 | 灰葡萄孢菌 | [78]

8. 免疫信号与次级代谢之间的交叉对话

植物激素在病原体攻击期间通过协调防御相关化合物、信号分子和结构屏障的产生，在调节初级和次级代谢中发挥核心作用。当宿主细胞受体检测到坏死性营养体真菌时，通过ROS等第二信使进行的信号转导启动了植物抗性反应，其中包括JA生物合成的激活和JA依赖信号级联的启动，该级联促进类黄酮、硫代葡萄糖苷、萜类和植物抗毒素的合成[84]。同样，在灰葡萄孢菌感染期间，JA/ET信号刺激花青素积累和ORA59依赖的防御基因（PR4和PDF1.2）表达[85]。在病原体感染后，抗病葡萄品种积累了更多的脯氨酸、甘露醇、木质素相关代谢物和苯丙烷类化合物，表明防御代谢得到改善[86]。病原体诱导的SWEET糖转运蛋白表达可改变糖分配并通过PAL介导的途径启动苯丙烷生物合成，这进一步证明了植物防御过程中激素调节的糖信号与次级代谢之间的紧密联系[87]。这些结果共同表明，激素网络整合了防御信号和代谢重编程，以最大化对坏死性营养体感染的抗性。

8.1. 防御代谢的转录调控

在坏死性营养体感染期间，复杂的转录网络整合了JA、SA和ROS信号，激活代谢重编程并增强抗病性。在水稻中，JA和SA响应基因的激活，包括OsMYC2、OsAOS2、OsOPR4、OsPAL1、OsICS1和OsPR1a，诱导了OsEIL2–OsWRKY67调控模块，并通过植物激素积累增强了对立枯丝核菌的抗性[88]。相反，OsEIL3也作为负调控因子发挥作用，通过抑制OsWRKY28和OsERF040转录模块，导致对立枯丝核菌的易感性增加[89]。当病原体诱导的JA信号通过SCFCOI1–26S蛋白酶体途径促进JAZ降解时，释放WRKY75以启动防御反应，而在非胁迫条件下，JAZ蛋白抑制WRKY75的活性。月季采用类似方法，通过JA介导的JAZ1降解来释放RcMYB84和RcMYB123，从而增强对灰葡萄孢菌的抗性[90]。

MYB34和MYB51转录因子的表达上调，连同包括CYP79B2、CYP79B3和CYP83B1在内的生物合成基因，导致芸薹属白菜在感染小菌核菌和灰葡萄孢后积累吲哚类芥子苷[91]。类似地，在感染灰葡萄孢的玫瑰中，RcTGA1与苯丙烷、黄酮和芥子苷的生物合成增加有关，同时防御相关酶的活性也增加，它通过SA信号传导正向调控抗性[92]。所有这些发现都表明，转录调控网络通过调控参与植物激素和次生代谢物生物合成的基因表达，针对坏死型侵染性病原体建立有效的防御。

9. 多组学整合与系统生物学方法

9.1. 多层组学整合以增强生物学解释

整合多个组学数据集（图4）是理解和解读植物生长、发育、胁迫耐受和抗病性背后的分子过程这一高度复杂的生物系统的一种强有力方法。多组学技术通过整合来自基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和表观基因组等多个分子层面的数据，提供单一组学研究无法获得的生物学过程全面理解。此类整合方法有助于发现新的分子相互作用、调控通路、生物标志物以及影响植物防御反应的关键因素[93]。多组学整合策略分为组合式、相关性式和机器学习式[93]。

为了对生物系统产生全面的理解，组合式整合方法汇集来自多个组学层面的数据集。该方法通常具有最强的可解释性，能够发现分子连接和调控机制，而单独检查数据集时可能忽略这些连接和机制。常用方法包括通路富集分析、差异表达基因和蛋白质比较、组学数据与基因组尺度代谢模型（GEMs）的整合以及基于互作组学的分析。例如，KEGG通路富集分析可以将差异表达基因与代谢物积累的变化联系起来，从而整合转录组和代谢组数据集，揭示代谢通路调控的信息。组合式策略对计算资源的需求相对较低，特别适用于宿主-病原体相互作用中不同分子层面的变化汇聚到同一过程或通路时。此外，转录组、代谢组和基因组尺度代谢模型的整合使得将基因型与表型联系起来以及预测不同生物学条件下的代谢功能成为可能[94]。例如，对大豆抗菌核病抗性进行整合的转录组、代谢组和化学基因组学分析将早期转录反应与茉莉酸积累、氧化还原调控以及苯丙烷通路的重新编程联系起来，而化学基因组学则促进了抗真菌活性的检测[95]。然而，在组合方法中各单个组学层面保留了其生物学可解释性，但它们严重依赖准确的功能注释和通路映射，并且常常忽略不共享已知注释的相互作用。因此，包含GEMs的复杂组合框架可以进一步纳入蛋白质组学约束以改善代谢预测[96]。

另一方面，相关性整合技术探讨基因、蛋白质、代谢物和其他分子成分之间的统计相关性。加权基因共表达网络分析（WGCNA）常被用来寻找表达模式相似的基因，并将模块与疾病表型关联，而基因-代谢物或蛋白质-代谢物相关网络分析可以识别宿主-坏死型病原体相互作用期间的协同生化变化网络。此外，相似网络融合（SNF）通过为每个组学层面分别构建独立的相似网络，然后将它们合并为单一网络，从而整合多个组学数据集并增强复杂生物学联系的识别[93]。同时，网络推断方法如GEne Network Inference with Ensemble of trees version 3（GENIE3）可以利用转录信息来确定其调控关系。这些方法共同确定了控制防御反应的分子成分、抗性模块和调控枢纽。例如，对五种野生番茄物种进行的WGCNA评估了针对坏死型病原体抗定量抗性的评估，鉴定出物种特异性抗性相关抗性模块[97]。进一步地，基于GENIE3的基因表达网络分析突出了NAC转录因子29作为关键的抗性调控因子，主要存在于S. pennellii中。总之，网络方法有能力揭示系统水平的关系和调控枢纽，而这些关系和枢纽无法从常规差异表达分析中识别出来。然而，网络拓扑结构也受样本量、标准化和相关性或算法选择的强烈影响[93]。

第三，机器学习使得分析庞大、复杂的高维生物学数据集成为可能，这进一步推动了多组学整合。基于机器学习的技术整合组学数据库以发现隐藏的模式、对生物样本进行分类、预测表型结果以及鉴定潜在的生物标志物。监督学习和无监督学习的算法都已被有效地用于生物学信息发现。监督方法包括稀疏偏最小二乘判别分析和基于潜在成分的生物标志物发现数据整合分析（DIABLO），它们组合多个组学矩阵同时选择区分预定表型的特征[89]。另一方面，无监督方法如多组学因子分析（MOFA）可以识别解释组学层面间变异的 key 因子[98]。类似地，贝叶斯关系学习（BayReL），另一种无监督学习方法，使用组学内部的先验关系来确定跨组学相互作用。然而，这些方法除了计算需求大且容易过拟合（尤其是当特征数超过生物学重复数时），总是需要仔细的考量、特征选择和独立验证。DIABLO在具有小型多组学特征且能区分抗性和感病表型时特别有用，而BayReL更适合复杂的关系结构[89,98]。一项整合分析涉及油菜与菌核病抗性中全基因组关联研究（GWAS）、多组学共定位和机器学习的联合应用，报道了与定量抗性等位基因相关的钙信号基因[99]。总体而言，这三种策略是互补的而非相互排斥的，因此结合通路水平信号、网络关系和预测建模可以提供稳健的系统水平理解，以解析宿主-坏死型病原体相互作用。

9.2. 网络分析以鉴定关键防御调控因子

多组学信息的整合已彻底改变了植物系统生物学，使得重建连接基因型和表型的调控网络成为可能。基于网络的方法通过整合转录组、蛋白质组、代谢组、磷酸化蛋白质组和表观基因组数据，提供了驱动植物防御反应的分子机制的系统水平理解[100]。其中，基因调控网络（GRNs）已成为理解免疫反应和防御激活如何通过转录因子、信号蛋白、非编码RNA及其靶基因协调的一种有效工具[101]。利用GENIE3、ARACNe、SCENIC和GRNBoost2等方法，计算生物学的进步使得从大量多组学数据集中重建GRNs成为可能，从而允许鉴定与疾病易感性或抗性相关的重要调控因子[102]。共表达网络分析方法，特别是加权基因共表达网络分析（WGCNA），已被广泛用于寻找枢纽基因和防御相关模块。例如，WGCNA显示，在番茄受到病原体和盐分胁迫联合胁迫时，SlWRKY33和SlNAC1等转录因子对于防御启动和氧化还原稳态至关重要[103]。在番茄-早疫病相互作用研究中，发现JA合成基因、受体激酶（RLKs）和乙烯响应因子（ERFs）是抗性网络中的重要调控元件。相比之下，感病植物表现出衰老相关基因表达上调以及JA和ET介导的信号传导减弱[104]。除了转录调控之外，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络为防御信号通路的组织提供了关键见解。利用整合互作组学分析，已鉴定出由激酶、泛素连接酶和调控免疫反应及胁迫适应期间蛋白质降解的信号蛋白组成的跨网络模块[105]。此外，通过整合转录组、蛋白质组和代谢组数据集，可以使共表达-代谢物相关网络成为可能，该网络可以识别连接转录调控与防御相关代谢重塑的调控枢纽。在将转录因子活性与代谢物积累及通量联系起来方面，这些方法增强了调控联系的预测。

多种组学数据集的整合已通过DIABLO、iOmicsPASS和多层次网络推断技术[106]等计算框架的建立得到加强。这些工具利用基于图和贝叶斯建模的技术，更容易识别共调控模块、通路串扰和重要调控枢纽。为了增强调控网络重建，贝叶斯网络推断考虑了先验生物学知识，如蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。同样，BayReL利用多组学整合和基于图的建模来重建复杂的调控网络并推断跨组学分子相互作用[107]。经常使用网络拓扑指标，如度中心性、介数中心性和接近中心性来发现作为防御通路重要调控因子的枢纽基因、瓶颈蛋白、转录因子和信号激酶。可以使用多种算法完成基因优先级排序，包括基于扩散的技术如随机游走重启（RWR）以及度中心性和介数中心性等中心性指标。这些技术也适用于其他类型的网络，如功能网络、共表达网络和PPI网络[108]。瓶颈节点通常显示强连通性并协调多种生物过程，枢纽节点通常显示强连通性并协调许多生物过程。PPI网络通常表示为无向图，其中节点是蛋白质，边是它们的相互作用。拓扑中心性指标有助于识别功能上重要的网络成分。瓶颈蛋白具有高介数中心性并占据网络模块之间的重要位置以促进信息流，而枢纽蛋白的特征是高度中心性和广泛连接。因此，鉴定这些节点可以突出PPI网络中关键的调控蛋白[109]。基于网络的方法已在多种作物物种中有效发现了防御相关调控因子。关于玉米抗南方玉米锈病的研究报告显示，防御相关模块集中在次生代谢和MAPK信号传导中，ABCG11和CCR1分别作为参与细胞壁加固和防御化学物质转运的重要调控因子出现[10]。总体而言，这些结果表明网络分析是一种有效的系统生物学方法，用于确定重要防御调控因子、阐明通路串扰并揭示控制植物抗坏死型感染的分子机制。

9.3. 基于AI-ML的植物防御反应预测

人工智能（AI）和机器学习（ML）已成为分析复杂生物学数据集和提高植物防御反应预测的强有力工具。ML算法可以通过在广泛的基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和表型数据集中发现隐藏模式，揭示通常难以用传统统计技术发现的调控联系[110]。无监督ML方法在未标记数据集中发现隐藏结构和关系，而监督ML使用标记数据集构建特定结果（如抗病性或易感性）的预测模型[111]。虽然聚类、回归和网络方法在无监督分析中很常见，但随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、决策树、人工神经网络（ANNs）、梯度提升技术和高斯过程模型是常见的监督算法[112]。随着多组学技术继续产生高维数据集，AI-ML驱动的分析框架对于鉴定抗病参数和提取具有生理意义的信息变得越来越重要。这些技术特别适用于管理复杂的基因型-表型相互作用、高维特征和植物防御中常见的非线性相关性。DRPPP、prPred和ResCap等专门平台进一步促进了从大型基因组数据集中快速鉴定潜在抗性蛋白[113]。效应蛋白预测是ML改善病原体生物学的另一种方式。利用基因组预测模型，已在多种作物中成功鉴定出抗性相关位点和分子标记。

9.4. 植物-坏死型病原体相互作用的表观基因组学

表观遗传机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，为坏死型防御增添了额外的调控层面，补充了上述转录组、蛋白质组和代谢组层面。由SET结构域蛋白SDG8介导的组蛋白H3K4甲基化对于充分激活JA/ET响应防御基因如PDF1.2a和VSP2是必需的，sdg8突变体植物对坏死型病原体表现出更高的易感性[41]。通过HUB1的组蛋白单泛素化同样有助于对坏死型真菌的基础抗性[114]，而病原体本身也能操纵宿主染色质。

B. cinerea效应蛋白已被证实可下调宿主防御位点组蛋白去乙酰化酶活性，从而有利于感染[115]。将全基因组亚硫酸氢盐测序、ChIP-seq和ATAC-seq获取的表观基因组数据与上述转录组、蛋白质组和代谢组层进行整合，越来越被认定为全面解析坏死营养型诱导的防御重编程调控逻辑所必需，这代表了未来多组学整合工作的重要前沿。

**10. 在作物改良中的转化应用**

与单组学方法不同，整合组学提供了连接基因型与表型的系统水平视角，有助于鉴定与复杂性状相关的关键调控基因、通路、代谢物和分子网络[5]。黄卷心菜花青素的生产与脂肪酸生物合成竞争前体丙二酰辅酶A，这影响了种子油含量——该发现源自基因组、转录组和代谢组的联合分析[116]。通过mGWAS、mTWAS和网络分析发现了BnaTT4和BnaC05.UK等关键调控因子，为通过分子育种提高产油量提供了可能的靶点。类似地，多组学研究揭示了与坏死营养型抗性相关的许多复杂防御机制和潜在基因。整合组织病理学、转录组和代谢组分析表明，对P. tritici-repentis的感病性以初级代谢和光合活性受损为特征，而抗性则涉及细胞壁重塑、囊泡运输和生长素介导的信号传导[117]。

基因组编辑为从多组学衍生候选基因直接获得持久的坏死营养型抗性提供了途径。番茄中被鉴定为感病因子的U-box E3连接酶基因SlPUB21经CRISPR/Cas9敲除后，在不产生显著多效效应的前提下，赋予了对B. cinerea和A. solani的广谱抗性[42]。类似地，CRISPR/Cas9敲除磷脂酶C2基因SlPLC2可减轻ROS依赖性细胞死亡并增强番茄对B. cinerea的抗性[118]。这些感病（S）基因编辑策略与上述R基因和QTL育种方法形成互补，说明了如何将组学衍生候选基因列表与靶向基因组编辑相结合，以加速培育持久的广谱坏死营养型抗性。整合组学与基因组编辑的转化潜力还延伸至水稻、小麦和玉米等主要粮食作物。一种整合方法已被用于阐明坏死营养型病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起纹枯病的分子基础。GWAS结合转录谱分析鉴定了一个抗性关联基因组区域qLN11Δ28，并报道ROS氧化还原调控是抗性的主要组成部分[119]。最近，转录组引导分析鉴定了两种钙结合蛋白OsCML36和OsCML45作为候选调控因子，其过表达有助于增强对R. solani的抗性[120]。另一项互补研究表明，CRISPR/Cas9对OsSWEET11基因启动子区域的编辑使蔗糖水平降低、R. solani生物量减少，且未产生重大农艺代价[121]。同样，在小麦中，包含全基因组测序、GWAS/QTL定位、蛋白质建模和基因表达分析的整合分析报道了SnTox5–Snn5相互作用是感小麦冠孢叶枯病（Parastagonospora nodorum）的主要因素[122]。CRISPR/Cas9对SnTox5的修饰证明效应蛋白靶向宿主感病基因Snn5并促进叶肉定殖[122]。类似地，在玉米中，整合组学与基因组编辑领域也取得了可比的进展。对487个玉米自交系的整合GWAS和转录组分析鉴定了90个与南方玉米锈病抗性相关的位点[123]。进一步的多组学优先级排序和VIGS沉默实验证明ZmHCT9的沉默增强了抗性。尽管南方玉米锈病由一种生物营养型锈菌引起，但该体系展示了整合组学在粮食作物病害抗性中更广泛的转化潜力。

整合组学已使鉴定除病害抗性之外控制关键生理和发育过程的调控11网络变得更加容易。棉花mRNA和miRNA联合分析揭示了一系列与黄萎轮枝病抗V. dahliae相关的潜在基因和调控模块，为抗性育种提供了有用工具[124]。此外，对黄卷心菜的转录组和代谢组研究鉴定了与抗倒伏和木质纤维素生产相关的重要调控机制，为通过定向育种技术改良作物提供了新机遇[125]。分子工程和测序技术的最新进展进一步增强地整合组学方法。Cas9靶向纳米孔测序（nCATS）使得高效测序六倍体小黑麦全长麦谷蛋白基因成为可能，证明了其在复杂基因组中鉴定重要农艺位点的价值[126]。总体而言，多层面生物数据的整合加快了利用基于系统的作物改良技术、精准育种和分子工程培育更优作物品种的过程。

**11. 新兴技术与未来展望**

单细胞和空间组学技术的最新发展彻底改变了我们对复杂生物系统的理解，使分子研究达到了此前难以企及的细胞分辨率。与传统组学技术不同，单细胞和空间组学方法使研究人员能够研究组织结构、发育轨迹和细胞类型特异性响应，从而更好地理解植物生长、发育和应激适应[127]（图5）。最近，一项关于拟南芥-核盘菌互作期间的单核RNA测序（snRNA-seq）研究鉴定了感染叶肉细胞间异质性转录状态，当与时间动态转录组整合后，显示在防御激活之前存在与钙相关的转录变异转变[128]。单细胞和单核RNA测序（sc/snRNA-seq）显示植物-病原互作中感染组织间存在显著变异，表明单个细胞群体可表现出与感病或抗性相关的不同转录状态。例如，对50000个草莓叶片真菌感染细胞的单细胞转录组分析显示，表皮、水孔、叶肉和其他细胞群体间表现出可变的响应，拟时间分析表明从正常细胞状态向防御相关状态的转变[129]。在另一项例子中，对90040个被刺盘孢菌感染的拟南芥叶片细胞的单细胞分析鉴定了细胞类型特异性NLR表达、局域化硫代葡萄糖苷响应和保卫细胞ABA信号传导，表明单细胞方法在解析植物中空间动态免疫方面具有更广泛的价值[130]。在单细胞水平结合转录组和表观基因组数据大大提高了我们对基因调控的认识。单核转座酶可及性染色质测序（snATAC-seq）是表征染色质可及性模式并鉴定与特定细胞类型相关的调控区域的一种常用方法[131]。scRNA-seq与snATAC-seq联合研究使跨多种植物组织重建细胞类型特异性基因调控网络和鉴定此前未知的细胞亚群成为可能[131]。尽管如此，这些方法目前仍然相对昂贵且计算需求高，有时受组织处理技术和原生质体偏倚的影响。因此，scRNA-seq和snATAC-seq最好被视为bulk转录组的补充而非替代。

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图5. 改善抗坏死营养型真菌病原菌抗性新兴策略的示意图。（1）用于高分辨率分子分析的高级组学技术；（2）深度多组学数据整合以实现全面的系统水平分析；（3）用于预测建模和鉴定关键防御调控因子的AI和机器学习；（4）用于实时病害监测和决策支持的数字孪生和精准农业；（5）用于工程化持久病害抗性的基因组编辑和合成生物学。

空间组学进一步回答了与真菌定殖相关的局域分子响应问题。虽然空间转录组学可将细胞特异性防御程序定位在感染位点、周围组织或远端区域，但基于质谱的空间代谢组学可绘制感染组织内防御代谢物的分布图。例如，对葡萄-B. cinerea互作的MALDI-MSI分析显示，感染区域周围存在空间限制的芪类植物抗毒素积累，包括白藜芦醇和低聚衍生物，这些通常被传统代谢组学所遗漏[132]。脂质组学的进展显著增强了我们对植物-病原互作期间脂质介导的信号网络和代谢重编程的理解。最近的基于质谱的脂质组学显著提高了脂质鉴定和定量的高通量性、灵敏度和准确性。数据依赖采集（DDA）和数据独立采集（DIA）技术——尤其是连续窗口采集所有理论碎片离子谱（SWATH）——增强了植物组织中低丰度脂质的鉴定和表征能力[133]。专用软件平台和计算机脂质库的建立简化了高通量脂质注释和数据解读，克服了当代脂质组学研究产生的大量谱图数据所带来的问题[134]。空间脂质组学也表明，受损伤、病原感染或冷胁迫的拟南芥植株中积累了多种氧化和酰基化的半乳糖脂，强调了脂质重塑在胁迫信号传导和防御响应中的作用[135]。总体而言，这些案例研究支持了一种分层策略：bulk多组学鉴定主要防御通路，而单细胞方法解析空间转录表达和代谢物定位。这两种组分的整合可将植物防御的平均描述转化为基于细胞或组织的宿主-坏死营养型互作模型。

**12. 多组学整合面临的挑战**

在系统水平的植物生物学中，尽管组学技术快速发展，整合多维数据集仍是一个重大挑战。主要问题在于数据类型的变异性，其在时间分辨率、尺度和噪声水平方面各不相同。不兼容的数据格式、批次效应和不一致的元数据进一步阻碍了可重复性和比较研究。转录后调控、代谢物周转和环境变异通常导致转录组、蛋白质组和代谢组数据之间相关性较差。NCBI GEO、PRIDE和MetaboLights等档案中存有大量组学数据集，但元数据注释不一致和预处理程序不统一阻碍了跨研究比较[136]。此外，缺失数据和批次效应损害了下游整合，凸显了强效标准化和插补技术的必要性[106]。从计算角度看，研究表明需要可扩展的框架来处理非线性关系和高维特征，以实现多层组学数据的整合。缺乏跨物种多组学数据融合、可视化和验证的既定流程，阻碍了可重复性和跨实验室协作[137]。尽管ML和DL模型在性状预测和基因网络推断方面已证明有效，但其"黑箱"性质限制了生物可解释性和科学可信度。另一方面，机制模型（如布尔网络和基于常微分方程的框架）提供了更高的清晰度，但可能存在扩展问题或过度简化系统复杂性。

除一般性挑战外，植物-坏死营养型互作中的多组学整合还受到若干生物学和实验性限制的制约，这些限制可能影响数据解读。一个主要问题在于宿主与病原菌生物分子的分离。坏死营养型真菌诱导宿主细胞死亡，导致感染位点存活宿主组织与真菌生物量比例迅速变化。因此，bulk RNA、蛋白质和代谢物谱可能代表宿主响应与病原菌活动的混合体。这对转录组和蛋白质组尤为重要，因为广泛的组织损伤可能改变宿主核酸和蛋白质的丰度。替代方案包括双RNA测序、物种特异性读段分配和空间或单细胞分析，但需要精心设计实验和高测序深度。第二个困难在于坏死营养型病斑在宿主组织中的空间和时间异质性。单片感染宿主叶片可能包含具有扩展病斑的坏死区域、近期感染但仍表面健康的区域以及具有系统性防御响应的远端区域。从这样的组织取样可能导致不同生物学过程被掩盖。虽然可见症状的组织可能捕获晚期宿主细胞死亡响应，但无症状组织可能遗漏感染初期发生的分子事件。因此，通过精确的病斑阶段取样并结合空间转录组学、代谢组学和激光捕获方法将对于区分局部感染响应与系统性效应至关重要。第三个主要困难在于将多组学发现在田间条件下进行转化。田间条件下的多组学分析表明，环境和空间变异可显著影响宿主和病原菌中转录物、蛋白质和代谢物的丰度。额外的变异也可能归因于接种物压力、病斑发展和病原毒力，尤其是坏死营养型病害。因此，候选多组学衍生物必须使用独立基因型在多点试验中于重复环境下进行验证，并通过过表达和沉默试验进行功能确认。总体而言，这些限制表明宿主-坏死营养型互作中的多组学方法应从静态分析转向时空采样和田间验证的实验设计，以提高多组学衍生抗性机制的生物学分辨率。

**13.**

**结论**

本研究所审阅的证据表明，寄主对腐生型真菌的抗性并非由单一防御途径决定，而是源于病原体识别、激素信号传导、活性氧调控、次级代谢、细胞壁加固以及脂质介导的信号传导和转录后调控等多种机制之间的协同作用。因此，有必要超越特定的分子层面，采用更高层次的方法才能全面理解这些反应。整合多组学技术为确定调控网络、生物标志物和潜在抗性因子提供了系统层面的框架，同时也能够将腐生型真菌感染过程中的转录、蛋白质组、代谢、表观基因组和脂质组学变化联系起来。然而，仍存在关键的不足。许多多组学研究主要停留在描述性层面，未能建立分子特征与抗性之间的明确关联。跨研究整合进一步受到空间和时空分辨率有限、寄主与病原体生物分子难以区分以及多组学数据在田间条件下验证不足等因素的限制。因此，未来关于寄主与腐生型真菌互作的研究应优先发展时空多组学分析、开发可解释的调控网络（而非基于特征的相关性分析），并利用基因编辑、互补实验和靶向分子检测对多组学衍生信息进行功能验证，以确立稳健的抗性机制。最终，这将有助于识别和部署针对腐生型真菌病害的持久抗性机制。

**CRediT作者贡献声明**

Subhashree Samal：验证、方法学、调查研究、形式分析、初稿撰写。

Tista Mallick：初稿撰写、验证、方法学、调查研究。

Raj Kumar Joshi：初稿审阅与编辑、指导、项目管理、资金获取、数据整理、概念构思。

**资金支持**

本工作由印度政府Anusandhan国家研究基金会（ANRF）核心研究资助（CRG/2023/000218）支持，授予Raj Kumar Joshi教授。

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奥里萨邦布巴内斯瓦尔市Rama Devi女子大学生物技术系，邮编：751022，印度