《Physiology & Behavior》：PACAP neurons of the ventral dentate gyrus are not involved in fear acquisition
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•PACAP-Cre小鼠与野生型小鼠之间未出现CNO剂量差异。•通过声音-电击组与仅情境-电击组和情境-无电击组的对比，确认了线索恐惧学习。•在温和电击条件下的两天恐惧训练中，vDG PACAP神经元未改变恐惧反应。•兴奋性DREADD组中观察到的效应反映的是时间特征差异，而
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PACAP-Cre小鼠与野生型小鼠之间未出现CNO剂量差异。
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通过声音-电击组与仅情境-电击组和情境-无电击组的对比，确认了线索恐惧学习。
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在温和电击条件下的两天恐惧训练中，vDG PACAP神经元未改变恐惧反应。
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兴奋性DREADD组中观察到的效应反映的是时间特征差异，而非整体幅度差异。
引言
许多生物体通过表现出焦虑样行为来适应应激或危险情境[1]。其中一些反应是通过经验习得的，在实验室中可通过恐惧条件化范式加以捕捉，由于恐惧条件化范式具有快速、稳健且持久的效应，被广泛用于研究学习和记忆的分子、细胞和神经基础[[2], [3], [4], [5]]。具体来说，在这些范式中，条件性恐惧反应（CR）发生在最初的中性刺激在与厌恶的非条件刺激（US）反复前向配对后成为条件刺激（CS）[6,7]时，或者当厌恶的US在CS呈现期间比在背景环境中体验得更多时[8]。换言之，该刺激获得了对即将发生的US的预测价值[9]。这指的是恐惧条件化的获得阶段。当主体随后在不与US配对的情况下再次暴露于同一刺激时（即测试阶段），它们会表现出对已习得恐惧反应的长期记忆，在啮齿类动物中通常表现为僵住反应，从而降低其被捕食者探测到的可能性。
数十年的恐惧条件化研究揭示了杏仁核在恐惧条件化情绪成分获得中的核心作用[10]。其他脑区也参与其中；例如，（除了中央杏仁核外）腹侧齿状回（vDG）通过其向丘脑的直接投射，在应激诱导的情感过程执行中发挥作用[11,12]，从而影响HPA轴、应激和情绪状态[13]。此外，杏仁核与vDG之间通过更广泛的腹侧海马网络存在功能交互[14]。
尽管预测性刺激是经历US的情境（情境恐惧条件化）还是先于US出现的离散刺激（线索恐惧条件化）决定了海马是否参与恐惧学习/记忆[10]，vDG已被证实参与了两种形式的恐惧条件化[[15], [16], [17], [18]]。为此，在训练前对包括vDG在内的腹侧海马进行电解损伤，选择性地损害了听觉恐惧条件化[17]，表明vDG对线索恐惧学习的获得有所贡献。另一方面，研究报告了海马损伤（包括vDG）后情境恐惧获得出现轻度损害[19,20]。这些发现表明，vDG对巴甫洛夫恐惧学习范式敏感，且损伤会产生依赖于时间和部位的类似失忆的效应。尽管如此，仍需要更精细、细胞类型特异性的方法来阐明vDG在恐惧学习中的精确作用。为此，Kheirbek等人[15]使用光遗传学调控vDG中的颗粒细胞活动，显示其对神经活动的操纵不影响情境学习，但抑制了先天焦虑。在一项近期研究中，CNO激活vDG苔状细胞中表达的hM3Dq DREADDs提高了情境恐惧测试中的僵住行为，表明vDG对情境恐惧记忆有所贡献[21]。对背侧齿状回（dDG）和vDG的操纵揭示了一个更为复杂的图景。具体而言，同时激活dDG和vDG中的苔状细胞减少了在学习到的情境中的僵住行为，并产生了性别依赖性效应。相比之下，抑制这些苔状细胞与mCherry对照组相比并未改变僵住行为[22]。综合来看，这些发现表明，当动物重新暴露于厌恶情境时，vDG支持恐惧表达，但这一功能可能取决于其与dDG的交互。支持这一观点的是，Fredes等人[23]通过化学遗传学激活和抑制vDG苔状细胞，证明其到dDG的长程投射关键性地塑造了情境恐惧记忆的形成。除长程投射外，vDG在恐惧学习中的局部功能尚未通过损伤和光遗传学研究得到阐明。
vDG中神经激素的功能受到防御行为的调节。垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）不仅被认为是一种中枢神经调节因子，也是一种真正的神经激素。它最初在下丘脑中被发现，因为它能够刺激垂体前叶细胞中的腺苷酸环化酶活性[24]，因此它满足神经激素的主要标准：由神经元产生并释放到垂体门脉系统中，从而影响内分泌靶组织。此外，PACAP调节垂体前叶激素分泌，并对应激期间下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的激活有重要贡献[25,26]。通过将神经信号与外周激素反应耦联，PACAP架起了脑活动与全身内分泌功能之间的桥梁；因此，其分类超越了神经传递，包含明确的神经激素作用。
在神经生物学层面，PACAP是调节应激反应和恐惧记忆形成的关键神经肽。通过作用于PAC1受体（PAC1R），PACAP影响应激相关的神经环路，特别是在杏仁核和海马中促进恐惧记忆的巩固。PACAP活性增加与创伤后应激障碍（PTSD）相关[27]，在PTSD中，它促成了对触发刺激/情境的更强且更持久的恐惧反应[28]。
多个与应激反应、学习、记忆和情绪加工相关的脑区表现出PACAP及其高亲和力受体PAC1的高表达[[29], [30], [31]]。PACAP信号通路可影响恐惧记忆在前额叶皮层、海马和杏仁核等区域的表达和强化方式[32]。特别是，PACAP已被证明可调节应激反应中海马不同亚区域的神经元活动。DG被认为是PACAP失调可能改变应激相关行为的关键区域[33]。PACAP缺陷小鼠已被证明表现出减弱的应激反应和减少的焦虑样行为[34,35]。
分子和细胞水平的研究揭示了PACAP-PAC1系统与DG环路之间的密切关系。最近的研究表明，vDG苔状区的苔状细胞表达PACAP-PAC1受体[31]。此外，PAC1基因失活的动物已显示出DG中的突触增强（LTP）减弱[36]。另一方面，在行为水平上，小鼠表现出依赖海马的任务障碍，尤其是情境恐惧条件化[32,36]。DG并非唯一受PACAP系统影响的海马区域。根据Schmidt等人[37]的研究，向CA1区域灌注PACAP增强了情境恐惧记忆的强化；另一方面，PAC1受体拮抗作用破坏了消退和强化过程。然而，PACAP-EGFP小鼠[38]和原位杂交研究[29]的证据显示，CA1和CA3区域的PACAP支配受到限制。这意味着海马PACAP信号的功能效应可能主要通过DG环路发生。
据我们所知，PACAP阳性神经元在恐惧获得期间于vDG中的直接因果作用尚未被研究；本研究通过在PACAP-Cre小鼠训练中前通过化学遗传学兴奋或抑制其活动来解决这一问题。为此，我们采取了保守的经验方法，首先在不转染DREADD的情况下测试小鼠，以控制CNO的脱靶效应。
章节片段
材料
所有实验均在Noldus Phenotyper?（型号3000）中进行，其地板面积为30 cm × 30 cm，高度为40 cm，墙壁为Plexiglas材质。测试箱放置在一个尺寸为50 cm × 50 cm × 50 cm的白色MDF箱体内，以隔绝环境干扰。通过不锈钢网格地板给予随机电击（0.25 mA）。使用Ethovision? XT控制听觉刺激和电击，并进行行为分析。
在PACAP-Cre小鼠中验证实验方案
我们首先验证了我们的行为方案——包括2秒、0.25 mA的电击——在测试期间产生了预期的行为结果。我们的预测是，声音-电击组在条件刺激（即声音）期间会表现出更大的僵住行为，而仅情境-电击组在情境中（前180秒）的僵住行为会比声音-电击组和情境-无电击组更大。确实，行为方案对
讨论
本研究进行了巴甫洛夫恐惧条件化，以考察vDG中PACAP神经元如何通过化学遗传学操纵对恐惧获得和编码做出贡献。在进行hM3Dq和hM4Di DREADDs向vDG的操作之前，进行了两项对照实验，以确定在缺乏AAV介导的受体表达的情况下，CNO是否本身会产生任何固有效应，方法是使用不同剂量的CNO（0、4和8 μM）在不同实验条件下测试PACAP-Cre小鼠，
结论
4 μM和8 μM剂量的CNO不会影响恐惧条件化，无论是单独作用还是与基因型交互作用，在PACAP-Cre雄性小鼠于获得日进行颅内注射后。因此，最高8 μM的CNO剂量可在本研究采用的恐惧条件化条件下作为经验安全的DREADD配体使用。基于这一经过验证的药理学框架，我们考察了化学遗传学操纵vDG中PACAP表达神经元对
资助
本研究由土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK）#122K010资助，授予EY。
伦理批准
所有实验均经Ko?大学动物研究当地伦理委员会批准（方案编号：2022.005）。
CRediT作者贡献声明
奥斯曼·卡马利：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式分析，数据整理。哈策尔·贝居姆·萨卡：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式分析，数据整理。富阿特·巴尔奇：撰写——审阅与编辑，可视化，监督，资源，方法学，形式分析，数据整理，概念构思。埃尔辛·亚瓦斯：撰写——审阅与编辑，
利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。
奥斯曼·卡马利|哈策尔·贝居姆·萨卡|富阿特·巴尔奇|埃尔辛·亚瓦斯
