基于EZ-D技术和逆转录-重组酶聚合酶扩增-侧向流检测的葡萄卷叶病毒3快速可视化免仪器现场检测

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Rapid, visual, and instrument-free on-site detection of grapevine leafroll-associated virus 3 based on EZ-D technology and RT-RPA-LFD

　　

**摘要** 葡萄卷叶相关病毒3（GLRaV-3）是葡萄卷叶病的主要致病原，其广泛传播严重阻碍了葡萄产业的可持续发展。因此，建立快速、准确的检测方法对于减缓该病毒的传播至关重要。本研究将基于玻璃纤维滤纸片的EZ-D核酸提取技术与逆转录重组酶聚合酶扩增-侧向流动试纸（RT-RPA-LFD）检测方法相结合，实现了GLRaV-3的现场可视化检测。该方法对GLRaV-3具有高度特异性，与其他常见葡萄病毒（如葡萄卷叶相关病毒1、2和4（GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-4）、葡萄病毒A（GVA）、葡萄灰皮针葡萄病毒（GPGV）以及葡萄扇叶病毒（GFLV））之间未观察到交叉反应。最佳反应条件为37°C反应10分钟，检测限为10 fg/μL。在检测条件下，RT-PCR的分析检测限为100 pg/μL，RT-LAMP为10 pg/μL。基于EZ-D技术和RT-RPA-LFD的整合检测方法已成功验证，可在田间20分钟内检测葡萄样本中的GLRaV-3，且无需使用仪器。该技术的突破为葡萄卷叶病的田间诊断和早期预防控制提供了关键技术支持。

**1. 引言**

葡萄（*Vitis vinifera* L.）是全球最具经济价值的果树作物之一，其产品广泛用于鲜食、干制和酿酒，具有产业链长、附加值高的特点[1]。近年来，全球葡萄种植面积显著增加，同时病害问题日益严重。葡萄卷叶病（GLD）已成为阻碍葡萄产业可持续发展的关键因素[2]。目前，已确定六个葡萄卷叶相关病毒（GLRaVs）种为GLD的致病原：GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4（包括变种GLRaV-5、-6、-9、-Pr、-De和-Car）、GLRaV-7和GLRaV-13[3]。其中，GLRaV-3是最为普遍且破坏性最强的病原之一[4]。研究表明，GLRaV-3对葡萄的生长发育产生不利影响，改变葡萄叶片的生理代谢，降低光合速率，导致产量损失和品质下降，最终影响葡萄酒的风味[5]。作为多年生木质藤本果树，葡萄一旦感染病毒，终生携带病毒。此外，通过无性繁殖材料和蚧壳虫等媒介昆虫进行远距离传播的能力给病害管理带来巨大挑战[6,7]。因此，开发一种快速、可视化、无需仪器的GLRaV-3现场检测方法，对于该病的早期诊断和有效防控至关重要。

目前，常规PCR[8]和实时定量PCR（qPCR）[9]常用于检测GLRaV-3。然而，这些方法往往耗时费力，依赖精密的实验仪器和高技能操作人员，不适合田间快速检测。等温扩增技术的出现为病原核酸的现场快速检测提供了新策略。这些技术在等温条件下即可实现高效核酸扩增，无需热变性步骤，从而仅使用便携式加热设备即可进行田间检测[10]。主要等温扩增方法包括链置换扩增（SDA）[11]、交叉引发扩增（CPA）[12]、逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）[13,14]、解旋酶依赖性等温DNA扩增（HDA）[15,16]、滚环扩增（RCA）[17]以及重组酶聚合酶扩增（RPA）[[18],[19],[20]]。其中，RPA以其高特异性、高灵敏度和短反应时间著称，无需精密仪器或复杂实验方案即可实现检测[21]。RT-RPA-LFD方法通过将逆转录RPA（RT-RPA）与侧向流动试纸（LFD）相结合，将目标RNA的扩增产物直接以胶体金试纸上的有色条带形式呈现，从而实现检测结果的简单可视化判读[22]。该技术体系已逐步应用于多种植物病毒的快速检测，显示出广阔的现场应用前景[23]。

近期已报道了一种针对GLRaV-3的RT-RPA方法[20]，但尚未与LFD结合以实现结果可视化。RT-RPA-LFD方法将RPA与LFD结合，有效消除了对精密热循环仪和凝胶成像系统等大型实验室仪器的依赖。然而，该系统在实际田间检测GLRaV-3的应用目前受限于繁琐的核酸提取程序。现有大多数方法采用传统的改良十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[24]或商业试剂盒[25]。这些方法通常步骤复杂、耗时较长、费力且高度依赖精密仪器，这极大地限制了RT-RPA-LFD技术在缺乏电力和实验室设施环境中的现场应用[26]。因此，开发一种简便、省时、省力的核酸提取方法，对于推动RT-RPA-LFD技术在葡萄病毒病害快速田间检测中的应用至关重要。目前，EZ-D技术[27]（基于直接裂解释放核酸）已受到广泛关注。该技术以玻璃纤维滤纸为主要介质，聚氯乙烯（PVC）树脂作为核酸结合区的把手和支撑结构。检测时，只需将滤纸片尖端浸入少量植物组织裂解液中，即可将核酸富集于结合区。经过快速洗涤去除杂质后，将结合区直接置于扩增反应液中，无需对粗提物进行进一步纯化。通过将EZ-D技术与RT-RPA-LFD系统有效整合，可以建立涵盖采样、裂解、扩增和显色的全流程一体化检测方案。便携式恒温设备（如保温杯或其他简易加热容器）即可驱动反应进行，大幅降低对专业实验室环境的依赖[28]。

基于上述思路，本研究以GLRaV-3为靶标，旨在建立并优化一种整合EZ-D技术与RT-RPA-LFD方法的快速、可视化、无需仪器的现场一体化检测系统。该系统旨在为基层植保人员、苗木繁育企业和口岸检疫部门提供一种实用、无需仪器且可视化的检测工具，对GLRaV-3的早期诊断和科学防控具有重要意义。

**2. 材料与方法**

**2.1 EZ-D试纸的制备**

按照Wang等人[27]的方法制备EZ-D试纸，并做了轻微修改。具体步骤如下：将Whatman玻璃纤维滤纸（Cytiva，美国）裁切成2 mm × 52 mm的条带。将市售自粘PVC片材（东恒塑料材料有限公司，中国）裁切成2 mm × 50 mm的条带，确保粘胶面由可撕的塑料保护膜保护。使用两片PVC条。撕去其中一片的保护膜后，将其粘胶面朝上放置。将玻璃纤维滤纸条置于其上，使滤纸一端与PVC条对齐，另一端超出2 mm。将第二片PVC条对齐第一片PVC条的边缘并用力压平，即制成EZ-D试纸。完成的EZ-D试纸由两个2 mm × 50 mm的PVC防水手柄和尖端暴露的2 mm × 2 mm滤纸采样区组成。

**2.2 基于EZ-D法的快速核酸提取**

该方法在Mason等人[29]的方法基础上进行了调整。简言之，取1.0 g葡萄叶组织置于提取袋中，加入裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 M NaCl；2% PVP；1% Tween-20），手工研磨10秒。将EZ-D试纸的滤纸端浸入匀浆液中，静置3秒以促使核酸结合。随后，将试纸转移至洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；0.1% Tween-20）中，上下移动洗涤5秒以去除可能干扰扩增反应的杂质。最后，将EZ-D试纸浸入扩增反应液中，静置5秒以洗脱核酸。

**2.3 RNA提取、逆转录和测序**

本研究收集了宁夏各地表现出病毒病症状的葡萄叶片。使用植物RNA提取试剂盒（Omega，美国）提取总RNA，并使用逆转录试剂盒（Vazyme，中国）合成互补DNA（cDNA）。经2%琼脂糖凝胶电泳验证后，将PCR产物送至 Sangon Biotech（上海）有限公司进行测序。所得序列与参考序列进行比对，并构建系统发育树以确定其系统发育类群。

**2.4 RT-RPA-LFD引物和探针的设计**

鉴于GLRaV-3具有较高的遗传多样性，为全面覆盖其已知系统发育类群，根据Liu等人[30]和Paulo等人[31]的分类系统，选取了16条衣壳蛋白（CP）基因序列（GenBank登录号：JX088241.1、DQ680141.1、JX088140.1、JN616386.1、HQ401019.1、HQ401018.1、JX088240.1、HQ401015.1、JX088183.1、EU344894.1、HQ401016.1、KX499448.1、OQ859099.1、MK955864.1、MT432386.1、KC477196.1）。使用MEGA12软件以邻接法构建系统发育树，进行1000次Bootstrap重复（图S1）。结果显示，16条参考序列聚类为I-V组，明确了它们的系统发育位置。此外，使用DNAMAN 8.0软件对16条参考序列进行多序列比对（图S2），并基于高保守区域设计了3条正向引物、3条反向引物和1条通用探针（图S3），共产生9种引物探针组合（表1）。引物长度为30至35个核苷酸，预期扩增产物大小为100至300 bp，GC含量为40%至60%。设计时注意避免发夹结构和引物二聚体。探针长度为46至52个核苷酸，5′端标记荧光基团，内部含有四氢呋喃（THF）无碱基位点，3′端以C3间隔基团终止以抑制聚合酶延伸。所有反向引物在5′端均标记生物素。

**表1. 本研究使用的引物和探针**

本研究中使用的引物和探针与表1中所列相同。

| 体系 | 引物/探针名称 | 引物和探针序列（5′-3′） | 扩增产物大小 |
|------|--------------|------------------------|------------|
| RT-RPA-LFD | F1 | GAGAAAGATCCAGACAAGTTCTTGAAGACT | 112 bp-290 bp |
| | F2 | TGAAGACTATGGGCAAGGGAATAGCTTTGG | |
| | F3 | TTAACGAGCCAGGGAAAGTATCAGTAGAGG | |
| | R1 | 生物素-AATTTTGTCTTAGTTGCTGCGTCATCGGC | |
| | R2 | 生物素-CAAGCAATCTGCATCACGTACAAGAAGAA | |
| | R3 | 生物素-TTTCCATCATCGGTTTCTATGTAGTCAAAC | |
| | P | FAM-AATGAAGATTAATGCCGCATTGATGGAGCT[THF]TGTAAGAAGGTTATG-C3间隔基团 | |
| RT-PCR | GLRaV-3-MSSq2-F | CGCTCATGGTGAAAGCAGACGT | 140 bp |
| | GLRaV-3-MSSq2-R | ACGCTCTACGCACGCAGTAAG | |
| | GLRaV-1-F | GACATGGAGGTTTCGGTAG | 386 bp |
| | GLRaV-1-R | ACTTCTCGTTCGGCTTCG | |
| | GLRaV-2-F | GTCTGCGGAGGTCATAAA | 163 bp |
| | GLRaV-2-R | CTTGTCGCCGTAAGTGTTG | |
| | GLRaV-4-F | ATACCAGGAATAGTGTCGG | 156 bp |
| | GLRaV-4-R | CTT CGGTGATGTAGAGTGTG | |
| | GVA-F | GTAGGCACAAGCAAGAAGG | 223 bp |
| | GVA-R | ACGAGGAAATCATAGGCG | |
| | GPGV-F | CGGTCGTGAAGGAATACAG | 196 bp |
| | GPGV-R | AACTTGGGATGCTTCTTGTG | |
| | GFLV-F | ATTATGGCAAGAGCACAG | 133 bp |
| | GFLV-R | AAATTCCCTATCAGCAAC | |
| RT-LAMP | GLCPF3 | CCAGACAAGTTCTTGAAGAC | |
| | GLCPB3 | TGCATCACGTACAAGAAGAG | |
| | GLCPFIP | CTCGTTAACAACTTTCGGTTTGTGTATGGGCAAGGGAATAGCTG | |
| | GLCPBIP | TCAGTAGAGGTGGCAATGAAGATTATCTTAGTTGCTGCGTCATC | |

**2.5 RT-RPA-LFD检测方法的建立**

RT-RPA扩增使用RNA等温快速扩增试剂盒（扩增未来有限公司，中国）进行，所有操作步骤严格按照制造商的指南执行。该试剂盒包含逆转录酶，允许以RNA为模板进行一步法RT-RPA-LFD反应。实验前，将Buffer A、Buffer B、去离子水、正向引物、反向引物、探针和试纸兼容稀释缓冲液均平衡至室温，充分涡旋并短暂离心。在试剂准备区，标记一根含有冻干酶粉的管。依次谨慎加入以下组分：29.4 μL Buffer A（高粘度）、2 μL正向引物（10 μmol/L）、2 μL反向引物（10 μmol/L）、0.6 μL探针（10 μmol/L）和8.5 μL去离子水。盖紧管盖并轻轻颠倒，直至冻干酶粉完全复溶。此时，反应管中包含除RNA模板和Buffer B以外的所有组分。将反应管和Buffer B通过传递窗移至样品处理区，并置于生物安全柜中，加入5 μL待测RNA模板。随后，将2.5 μL Buffer B引入管盖内壁，并迅速关闭管盖。将反应管转移至扩增分析区，颠倒八次以确保混合均匀，并短暂离心将反应液收集于管底。按照制造商说明，在40°C金属浴中孵育15分钟。扩增完成后，取10 μL扩增产物加入190 μL试纸兼容稀释缓冲液中，充分涡旋并短暂离心。取80 μL稀释液滴加于核酸检测试纸（扩增未来有限公司，中国）的样品垫上，室温显色5分钟。通过目视观察控制线（C线）和检测线（T线）的显色情况来判读结果。

**2.6**

RT-RPA-LFD反应条件的优化 为建立GLRaV-3的最优RT-RPA-LFD检测体系，对反应温度（19、22、25、28、31、34、37和40°C）、反应时间（1、5、10、15、20、25、30和35 min）、探针母液浓度（0.1、1、5和10 μmol/L）以及上下游引物母液浓度（0.1、1、5和10 μmol/L）进行了单因素优化，其余反应条件保持不变。通过该优化过程，建立了最优反应体系，成功避免了假阳性结果，并在胶体金试纸条上实现了对GLRaV-3的快速检测。

2.7. RT-RPA-LFD检测的特异性 为评估已建立的RT-RPA-LFD检测体系对GLRaV-3的检测特异性，提取了先前确认的单感染的葡萄卷叶相关病毒1、2和4（GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-4）、葡萄病毒A（GVA）、葡萄灰皮诺病毒（GPGV）以及葡萄扇叶病毒（GFLV）样品的RNA。这些样品构成了特异性评价面板。值得注意的是，与GLRaV-3同属于Ampeivirus属的GLRaV-1和GLRaV-4与其亲缘关系相对较近。相比之下，GLRaV-2、GVA、GPGV和GFLV属于不同的科或属，但它们是田间常见的可混合感染葡萄的病毒。以每种病毒的RNA作为模板，GLRaV-3 RNA作为阳性对照，无病毒葡萄组培苗的总RNA和ddH2O作为阴性对照。为模拟田间混合感染情况，参考Zhang等人[32]的方法并稍作修改。将GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-4、GVA、GPGV和GFLV的RNA与GLRaV-3 RNA等量混合，生成混合感染RNA模板，随后通过RT-RPA-LFD进行检测，以评估在混合感染条件下对GLRaV-3的特异性。

2.8. RT-RPA-LFD检测的灵敏度 为评估已建立的RT-RPA-LFD检测体系的灵敏度，对GLRaV-3总RNA进行10倍系列稀释，生成七个浓度梯度：1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL。在优化的反应条件下，以各浓度RNA作为模板进行RT-RPA-LFD检测，并设置阴性对照。实验进行了三次独立重复。检测限（LOD）定义为三次重复中均能持续观察到阳性检测线（T线）信号的最低RNA浓度。

2.9. RT-PCR检测的灵敏度 GLRaV-3总RNA同样进行10倍系列稀释，浓度为1000 ng/μL、100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL。针对GLRaV-3设计了特异性引物[33]并进行合成（序列详见表1）。随后以各稀释度RNA作为模板进行RT-PCR扩增。一步法RT-PCR在25 μL反应体系中进行，包括1 μL RNA、上下游引物各1 μL、禽骨髓瘤白血病病毒逆转录酶（AMV）1 μL、Max Taq DNA聚合酶12.5 μL和无RNase水8.5 μL。热循环程序包括：95°C预变性3 min；随后35个循环，95°C 30 s、60.5°C 35 s、72°C 35 s；最后72°C延伸7 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离，使用Tanon 1600凝胶成像分析系统（上海天能生命科技有限公司，中国）进行观察。检测灵敏度定义为能产生清晰特异性条带的最低RNA浓度。

2.10. RT-LAMP检测的灵敏度 基于GLRaV-3的CP基因序列，使用PrimerExplorer V5软件设计了一组特异性引物，共获得四条引物：两条内引物（FIP/BIP）和两条外引物（F3/B3），序列见表1。在总反应体积25 μL中进行了一步法RT-LAMP反应，反应体系包括：40 μmol/L FIP和BIP引物各1 μL、10 μmol/L F3和B3引物各1 μL、RNA模板1.5 μL、禽骨髓瘤白血病病毒（AMV）逆转录酶1 μL、8 U/μL Bst DNA聚合酶1 μL、100 mmol/L MgSO4 1.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2.5 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、5 mol/L甜菜碱5 μL和ddH2O 6 μL。扩增反应在65°C恒温下进行60 min。反应结束后，取7 μL RT-LAMP扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。判读标准为：出现梯状条带表示阳性样品，无条带表示阴性样品。作为替代方法，可在反应前向管盖内壁加入1 μL 10倍稀释的SYBR Green I（1000×）。反应结束后，离心混合管内内容物，在自然光和蓝色光照下观察扩增产物。样品在蓝光下呈现绿色荧光判定为阳性，保持橙红色且无荧光者判定为阴性。

为评估灵敏度，对GLRaV-3总RNA进行10倍系列稀释，生成七个浓度梯度：1000 ng/μL、100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL。以各稀释度RNA作为模板，同时设置阴性对照（CK），使用指定的RT-LAMP体系进行检测。扩增结果通过凝胶电泳确认。RT-LAMP检测的灵敏度定义为能产生明确阳性信号的最低RNA浓度。

2.11. RT-RPA-LFD现场检测GLRaV-3平台的构建 为方便RT-RPA-LFD在不依赖精密实验室仪器的情况下独立应用，本研究在Zhang等人[32]报道的方法基础上进行了改良，开发了一个简便的现场检测平台。该平台仅需少量必备物品，包括预制EZ-D条、数字显示保温杯、RPA反应预混液和移液设备即可完成全部检测流程。具体步骤如下：在提取袋中将裂解缓冲液与葡萄叶片样品混合研磨以释放核酸（图1A和B）。将EZ-D条浸入裂解液3 s以吸附核酸（图1C）。取出后，将试纸条转入洗涤缓冲液中5 s以去除可能干扰RPA反应的杂质（图1D）。随后将试纸条浸入预制的RPA反应预混液5 s以洗脱核酸，该核酸将作为扩增模板（图1E）。将RPA反应预混液放入装有37°C水的保温杯中[34]，孵育10 min（图1F和G）。孵育结束后，将扩增产物稀释20倍并滴加到胶体金试纸条上，5 min内即可通过肉眼直接判读结果（图1H）。

图1. GLRaV-3快速诊断的现场可视化检测平台。（A）将样品加入预装裂解缓冲液的研磨袋中。（B）研磨样品10 s后，在袋上戳一个孔。（C）使用EZ-D试纸条捕获核酸。（D）用洗涤缓冲液清洗试纸条。（E）将核酸洗脱至RT-RPA反应液中。（F）将反应液转移至保温杯中。（G）在保温杯中37°C恒温扩增10 min。（H）将LFD试纸条浸入稀释的RT-RPA产物中，5 min内即可通过肉眼观察结果。

2.12. RT-RPA-LFD平台用于GLRaV-3现场检测的应用 为评估RT-RPA-LFD平台用于田间样品检测的适用性，从宁夏各葡萄种植区收集了34份表现出GLRaV-3典型感染症状的叶片样品和34份无症状叶片样品，作为待测样品。GLRaV-3 RNA作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照。使用基于EZ-D的快速核酸提取方法从叶片样品中粗提取核酸，并作为RT-RPA-LFD模板，以验证该平台在现场诊断中的性能。同时，所有68份样品均通过RT-PCR进行检测，结果用于比较分析两种检测方法的一致性。

3. 结果

3.1. 葡萄核酸快速提取的效率 为验证EZ-D方法获得的核酸模板的适用性，按照图2B所示流程快速提取核酸。将EZ-D条回收的粗核酸（图2A）和商品化试剂盒纯化的RNA分别作为一步法RT-PCR模板。两种模板均产生预期大小的GLRaV-3清晰条带（图2C），证实了目标病毒序列的高效扩增。在RT-RPA-LFD检测中，粗EZ-D提取物获得的检测线信号强度低于纯化RNA（图2D）。然而，同一样品的定性结果（阳性/阴性）在两种模板类型之间完全一致。此外，使用EZ-D快速提取法和商品化试剂盒纯化法从同一葡萄叶片样品中提取核酸，进行三次独立技术重复；各重复之间未观察到差异（图S4）。这些结果表明，通过EZ-D方法粗提取的核酸可直接用作RT-RPA-LFD检测GLRaV-3的模板，满足快速现场检测的要求。

图2. EZ-D快速核酸提取用于GLRaV-3检测。（A）EZ-D试纸条示意图。（B）使用EZ-D试纸条进行快速核酸提取的流程示意图。（C）以粗核酸或试剂盒提取RNA为模板对GLRaV-3进行RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，以ddH2O为阴性对照；M，Marker；NA，核酸；NTC，无模板对照；泳道1、2和3代表三次独立重复。（D）以粗核酸或试剂盒提取RNA为模板对GLRaV-3进行RT-RPA-LFD扩增产物的LFD试纸条检测。

3.2. GLRaV-3 RT-RPA-LFD引物的筛选 为排除引物或探针本身导致假阳性结果的可能性，将三条上游引物（F1、F2和F3）与三条下游引物（R1、R2和R3）及探针（P）组合配对，在无模板的情况下进行扩增，随后通过试纸条显色检测。结果显示，九种组合在检测线（T线）上均未出现假阳性条带（图3A）。随后使用1 pg/μL RNA作为模板进行阳性筛选。如图3B所示，F1-R1-P组合产生了清晰的阳性条带和正常的对照线，在所有组合中显示最高清晰度。该结果表明其具有优异的扩增效率和特异性。相比之下，其他组合或产生清晰度较低的检测线，或在某些情况下完全未产生可见检测线，表明灵敏度或扩增效率不足。因此，选择F1-R1-P组合作为最优引物-探针组合，并用于后续实验。

图3. GLRaV-3引物的阴性对照验证和阳性筛选。（A）以ddH2O为模板进行RT-RPA-LFD引物验证。（B）以GLRaV-3总RNA为模板进行RT-RPA-LFD引物筛选；C，对照线；T，检测线。

3.3. GLRaV-3检测RT-RPA-LFD体系的优化 RT-RPA-LFD检测在探针母液浓度为10、5、1和0.1 μmol/L条件下进行。结果表明，在探针母液浓度为10 μmol/L时，试纸条上观察到清晰且强烈的检测线。随着母液浓度降低，检测线强度减弱直至完全消失（图4A）。因此，确定10 μmol/L为RT-RPA-LFD检测的最优探针母液浓度。

图4.

葡萄红叶病相关病毒3（GLRaV-3）检测反应条件优化。
（A）GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测探针储液浓度优化。
（B）GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测引物储液浓度优化。
（C）GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测反应温度优化。
（D）GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测反应时间优化；C，对照线；T，检测线。

在探针储液浓度为10 μmol/L的条件下，进一步对引物储液浓度（10、5、1、0.1 μmol/L）进行优化。结果（图4B）表明，随着储液浓度降低，检测线（T线）信号强度逐渐减弱并最终消失。因此，选择10 μmol/L作为最优引物储液浓度。

利用优化后的探针储液浓度（10 μmol/L）和引物储液浓度（10 μmol/L），进一步对反应温度和反应时间进行优化。以感染GLRaV-3的样本为模板，在19~40℃范围内进行扩增和胶体金试纸条显色反应。结果（图4C）显示，除19℃外，所有测试温度下均可见红色检测线（T线）。37℃时T线信号最强且最清晰，而40℃时信号强度有所下降。考虑到37℃可获得最佳检测信号，且该温度易通过保温杯等简易设备维持，便于现场检测，因此将37℃定为RT-RPA-LFD检测的最优反应温度。

对RT-RPA-LFD检测反应时间进行梯度优化（1~35 min）。结果（图4D）显示，阳性样本在5 min时即可检测到微弱T线信号，10 min时信号清晰，10~30 min内信号基本稳定，35 min时T线信号略有下降。综合考虑时间效率与检测灵敏度，选择10 min作为RT-RPA-LFD检测的最优反应时间。该条件不仅能确保检测带清晰显现，还显著缩短了检测时间，符合现场快速检测的需求。

### 3.4 GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测特异性评估
以表1所列引物，对GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GVA、GPGV和GFLV提取的RNA进行RT-PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示，7种病毒RNA均扩增出预期大小的条带（图5A），证实阳性样本可靠。将RT-PCR验证的RNA样本作为模板，在已建立的RT-RPA-LFD检测体系中进行检测，以无病毒葡萄组培苗组织总RNA和ddH?O作为阴性对照。在37℃条件下扩增10 min后，将产物加样至侧向流试纸条进行特异性评估。结果表明，仅GLRaV-3模板在检测线（T线）处产生清晰红色条带，且对照线（C线）可见；其他病毒样本及阴性对照在T线处均无显色信号（图5B）。在模拟混合感染条件下，所有含GLRaV-3的混合感染模板均在T线处产生清晰条带，且C线可见，表明该检测体系在混合感染条件下可特异性检测GLRaV-3，不受其他病毒RNA干扰（图5B）。

**图5 GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测特异性**
（A）7种病毒RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证；M，Marker；NC，阴性对照；NTC，无模板对照。
（B）7种病毒用于GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测特异性验证；1，GLRaV-1 + GLRaV-3；2，GLRaV-2 + GLRaV-4 + GLRaV-3；3，GVA + GPGV + GFLV + GLRaV-3；C，对照线；T，检测线。

### 3.5 GLRaV-3 RT-RPA-LFD检测敏感性评估
为评估RT-RPA-LFD系统对葡萄红叶病相关病毒3（GLRaV-3）的检测敏感性，对GLRaV-3 RNA模板进行10倍梯度稀释（浓度范围1 ng/μL至1 fg/μL），并进行RT-RPA-LFD检测。随着模板浓度降低，试纸条检测线颜色强度逐渐减弱（图6A）。100 fg/μL组可见清晰T线条带，10 fg/μL组仅可见微弱条带轮廓，1 fg/μL组及阴性对照未检测到条带。在优化条件下，设置3个独立重复实验，结果一致（图S5）。结果表明，该方法对GLRaV-3的检测限为10 fg/μL。

**图6 RT-RPA-LFD、RT-LAMP和RT-PCR检测敏感性比较**
（A）RT-RPA-LFD检测敏感性验证；C，对照线；T，检测线；NTC，无模板对照。
（B）RT-PCR检测敏感性验证（琼脂糖凝胶电泳分析）。
（C）RT-LAMP检测敏感性验证（琼脂糖凝胶电泳分析）。
（D）RT-LAMP检测敏感性验证（肉眼荧光观察）。
（E）RT-LAMP检测敏感性验证（蓝光透射成像荧光检测）。

为进一步评估不同检测平台的敏感性差异，对GLRaV-3 RNA进行10倍梯度稀释，并将RT-RPA-LFD检测性能与常规RT-PCR和RT-LAMP进行比较。RT-PCR分析显示，随着模板浓度降低，扩增条带强度逐渐减弱，100 pg/μL时仍可检测到微弱但可辨的条带（图6B），检测限为100 pg/μL。RT-LAMP检测中，电泳条带信号强度随RNA模板浓度降低而规律性下降（图6C），1 pg/μL时未观察到电泳条带。经SYBR Green I染色后，反应液颜色在自然光下由绿色逐渐变为橙红色（图6D），蓝光透射成像下荧光强度亦逐渐减弱（图6E）。结合电泳与荧光检测结果，RT-LAMP的检测限为10 pg/μL。

在相同实验条件下，各方法检测限分别为：RT-PCR为100 pg/μL，RT-LAMP为10 pg/μL，RT-RPA-LFD为10 fg/μL。结果表明，本研究建立的RT-RPA-LFD检测方法对GLRaV-3的敏感性显著高于两种常规检测方法，更适用于低病毒载量样本的检测。

### 3.6 RT-RPA-LFD平台用于GLRaV-3现场快速、可视化及同时检测的验证
以EZ-D方法制备的粗提核酸模板，对宁夏地区68份田间叶片样本（含34份典型GLRaV-3症状样本（图7A）和34份无典型症状样本（图S6A））进行GLRaV-3检测。RT-RPA-LFD检测结果显示，23份症状样本（图7B）和14份无症状样本（图S6B）检测线呈阳性。对同批68份样本进行平行RT-PCR分析，结果在相同23份症状样本（图7C和D）和14份无症状样本（图S6C和D）中检测到预期目标条带。结果表明，RT-RPA-LFD与RT-PCR检测结果完全一致，验证了EZ-D-RT-RPA-LFD系统在实际田间检测中的可靠性。

**图7 RT-RPA-LFD检测田间应用表现**
（A）从宁夏各葡萄种植区随机采集的疑似叶滚病症状葡萄样本（编号1-34）。
（B）34份田间样本RT-RPA-LFD检测结果。
（C、D）34份田间样本RT-PCR检测结果。M，Marker；NC，阴性对照；PC，阳性对照。

### 4. 讨论
以EZ-D方法获得的粗提核酸为模板时，侧向流试纸条检测线（T线）颜色强度略弱于纯化RNA模板。但在本研究确定的检测阈值内，阳性结果定性判断未出现差异。这表明，尽管粗提物中可能含有少量杂质导致扩增效率略有下降，但仍能满足田间检测需求。该结论与Zang等[35]的报道一致，即EZ-D方法快速提取的核酸常保留多糖、多酚等植物源抑制物，进一步证实了该粗提技术用于快速田间检测的可靠性。

常规RT-PCR是分子诊断的金标准[36]，但该方法操作繁琐、需精密仪器，难以满足大规模样本检测需求。实时荧光RT-PCR取消了电泳步骤，可实时监测扩增过程，但设备昂贵且需专业操作人员，限制了其在田间的应用。RT-LAMP作为一种成熟的等温扩增技术，摆脱了对高精度热循环仪的依赖，显著降低了设备门槛。尽管可通过肉眼判读，但引物设计复杂及非特异性扩增风险等固有缺陷，限制了其在基层快速检测中的应用。本研究建立的RT-RPA-LFD检测将逆转录与RPA扩增整合为一步法，在37℃等温条件下仅需10 min即可完成高效扩增，扩增产物可在5 min内通过侧向流试纸条直接肉眼判读，无需额外检测设备。该特点使其特别适合基层现场快速检测。

Zhao等[37]指出，RT-RPA-LFD扩增效率极高，导致大量扩增产物在反应体系中积累。在开盖、加样或稀释操作过程中，可能产生核酸气溶胶或携带污染，这些污染物可在后续反应中作为高效模板，导致假阳性结果。该问题在连续处理大量样本或通风不良环境中尤为突出，可能影响方法在田间应用中的可靠性。为降低该风险，操作中需严格区分试剂配制区、样本处理区和扩增产物分析区。此外，定期清洁工作台面和实验工具可进一步降低污染风险。在田间条件下，工作区严格物理隔离往往不现实，且封闭管装置可能不可用或成本过高。针对这些限制，应尽量减少开盖次数，在远离样本处理和试剂配制区域进行扩增产物稀释及侧向流试纸条加样。

RT-RPA-LFD检测的敏感性因目标病毒而异。Zhang等[32]研究表明，对甘蔗花叶病毒（SCMV）的检测敏感性是RT-PCR的10万倍；Kim等[38]报道，对蝴蝶兰矮缩病毒（CymMV）的RT-RPA-LFD检测敏感性是RT-PCR的100倍。本研究以总RNA为模板，RT-RPA-LFD对GLRaV-3的检测敏感性达10 fg/μL，比常规RT-PCR高1万倍，比RT-LAMP高1000倍。该高敏感性可有效检测低病毒载量样本，满足葡萄苗圃中低毒株带毒苗木及潜伏感染样本的检测需求，显著降低因低浓度病毒漏检导致的误判风险。

然而，这些比较旨在评估新方法相对于两种广泛使用平台的表现，而非宣称其固有优势。RT-PCR需精确温控的热循环；RT-LAMP依赖链置换酶和多引物在等温条件下扩增；RT-RPA则通过重组酶介导引物入侵实现扩增，无需热变性。此外，RT-PCR和RT-LAMP通常需琼脂糖凝胶电泳结合核酸染色，而RT-RPA-LFD使用胶体金侧向流试纸条。这些反应机制和检测方式的差异，必然导致扩增动力学和信号读出特性的不同，无法直接比较固有扩增效率。因此，观察到的敏感性差异应视为在特定实验条件下不同化学体系、读出系统及引物/探针配置的综合作用结果，而非证明RPA效率本身具有绝对优势。

尽管本研究建立的方法检测性能良好，但实际应用中仍有一些局限性需要考虑。

不同GLRaV-3分离株之间的遗传变异可能会影响引物结合效率[39]；因此，必须定期评估和更新引物及探针序列，以确保检测系统的持续有效性。此外，结果的判读依赖于对LFD（侧向流动试纸条）测试线颜色强度的目视观察。当模板量接近检测限时，微弱条带可能导致不同操作者之间的主观判读差异，增加边界性假阳性或假阴性结果的风险。因此，建议在标准化应用场景中引入比色卡或便携式读取设备作为辅助验证工具，以提高结果的客观性和一致性。CRediT作者贡献声明王瑞：撰写初稿、可视化、研究。郝新怡：撰写审校与编辑、方法论。李城南：撰写审校与编辑、研究。俞泽阳：撰写审校与编辑、资源。单守明：撰写审校与编辑、概念化。姚文空：撰写审校与编辑、监督。殷晓：资金获取。资金支持本工作得到了宁夏回族自治区重点研发计划（2024BBF01002）、国家市场监督管理总局科技计划项目（2024MK134）以及宁夏大学研究生创新创业计划（CXXM2026-021）的资助。王瑞|郝新怡|李城南|俞泽阳|单守明|姚文空|殷晓宁夏大学葡萄酒与园艺学院，中国银川，邮编750021