p53野生型/低c-Myc表达的小儿髓母细胞瘤ONS76细胞经γ射线照射后发生衰老并可由衰老细胞清除剂消除

《Cell Death Discovery》：p53 wild-type/low c-Myc-expressing ONS76 pediatric medulloblastoma cells become senescent after gamma-irradiation and can be eliminated by senolytic substances

　　

颅脊髓照射（craniospinal irradiation, CSI）是小儿髓母细胞瘤肿瘤治疗中不可或缺的一部分。然而，尽管显著改善了肿瘤学结局，它也伴随严重的短期和长期副作用，如炎症和神经认知损伤。衰老细胞的存在已被确定为这些问题的潜在促成因素。在该研究中，研究人员证明，p53野生型且低c-Myc表达的ONS76髓母细胞瘤细胞在γ射线照射（gamma irradiation, γIR）后发生衰老，即一种终末且稳定的细胞周期停滞。相比之下，p53突变的UW228-3细胞在相同处理后表现出凋亡。ONS76细胞表现出典型的衰老特征，包括细胞和核增大、活跃的DNA损伤应答（伴随p53的稳定化及其靶基因CDK抑制剂p21^WAF1/CIP1表达增加），以及衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated beta-galactosidase, SA-βG）活性升高和脂褐素积累。用siRNA敲低p53或p21表达可消除γIR介导的衰老。此外，c-Myc过表达导致γIR处理后从衰老部分转向细胞死亡诱导，而这种细胞死亡可被半胱天冬酶抑制剂q-VD-OPh抑制。γIR暴露的ONS76细胞对衰老细胞清除剂（senolytic substances）敏感，如BCL-2家族抑制剂Navitoclax和PI3K抑制剂PX-866与BAY80-6946，这些药物特异性靶向衰老细胞。总之，对具有野生型p53和低c-Myc表达的受照髓母细胞瘤细胞使用senolytics，可能导致治疗副作用的减少，并减轻肿瘤复发，同时可能最小化有效消除肿瘤细胞所需的CSI剂量。

小儿髓母细胞瘤（medulloblastoma）是儿童最常见的恶性脑肿瘤，其标准治疗方案包括手术切除、颅脊髓照射（craniospinal irradiation, CSI）和化疗。CSI虽然显著改善了肿瘤学结局，但会引发严重的短期和长期副作用，如炎症和神经认知损伤。近年来，衰老细胞（senescent cells）的持久存在被确定为这些副作用和肿瘤复发的潜在推动因素。细胞衰老（cellular senescence）是一种终末稳定的细胞周期停滞，可由DNA损伤应激诱导，其执行依赖于p53及其靶基因p21^WAF1/CIP1。在髓母细胞瘤中，SHH活化亚型根据p53状态分为野生型和突变型，两者预后差异显著。此前研究已表明细胞衰老是髓母细胞瘤前体细胞的默认肿瘤抑制程序，但放射治疗诱导髓母细胞瘤细胞衰老的现象尚未被系统分析。因此，研究人员在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，使用p53野生型ONS76和p53突变型UW228-3两种SHH活化髓母细胞瘤细胞系，探究γ射线照射（gamma irradiation, γIR）后的细胞命运，并进一步分析c-Myc过表达的影响以及衰老细胞清除剂（senolytic substances）能否消除放疗诱导的衰老细胞。

在技术方法上，研究人员将两种细胞系暴露于不同剂量γIR，采用显微镜形态观察和衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated beta-galactosidase, SA-βG）染色定性衰老；利用流式细胞术结合C₁₂-FDG底物或脂褐素结合探针GLF16与活性染料Zombie-violet同时定量衰老和死亡细胞；通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放和半胱天冬酶（caspase）活性测定评估细胞死亡；使用Western blot检测p53、p21、Bcl-2表达；通过siRNA敲低p53或p21验证功能；运用qRT-PCR检测p21 mRNA水平；并使用稳定过表达c-Myc或mCherry的细胞系及senolytic药物（Navitoclax、Venetoclax、PX-866、Bay80-6946）处理。细胞系ONS76和UW228-3由P. Landgraf（德国科隆大学）提供。

研究结果分四个部分。第一，γIR induces a senescent-like morphology and SA-beta-galactosidase activity in wild-type p53 ONS76 cells：显微镜观察显示，20 Gy γIR后ONS76细胞保持贴壁，形态变得扁平，细胞和核体积增大，SA-βG活性在11天内持续升高；而UW228-3细胞在照射后3至7天脱落死亡。这提示野生型p53细胞放疗后呈现衰老样形态。

第二，γIR induces p53/p21-dependent senescence in ONS76 cells but apoptosis in p53-mutated UW228-3 cells：流式细胞术检测到ONS76细胞中SA-βG阳性细胞比例随γIR剂量增加，而UW228-3细胞无此现象；UW228-3细胞在9和16 Gy后出现LDH释放和caspase活性升高，且可被泛caspase抑制剂q-VD-OPh完全抑制，表明其发生凋亡；Western blot显示ONS76细胞中p53和p21蛋白剂量依赖性上调，Bcl-2下降，而UW228-3中突变p53和高水平p21未诱导。siRNA敲低p53或p21后，ONS76细胞在16 Gy后细胞死亡显著增加、衰老显著减少。由此证明ONS76的衰老依赖于p53/p21轴。

第三，c-Myc-overexpression represses γIR-induced senescence and increases cell death：在稳定过表达c-Myc的ONS76细胞中，γIR诱导的p21蛋白水平降低（但p21 mRNA未受影响），衰老细胞比例下降，而Zombie-violet阳性细胞和LDH活性增加；c-Myc过表达引起的额外细胞死亡可被q-VD-OPh抑制，且不伴随caspase活性升高。在UW228-3细胞中c-Myc过表达也增加细胞死亡，表明c-Myc的作用不依赖p53功能状态。这些结果表明c-Myc通过降低p21蛋白水平部分抑制衰老并转向细胞死亡。

第四，Therapy-induced senescent ONS76 cells are susceptible toward senolytic treatments：研究人员在γIR诱导衰老的ONS76细胞（照射后第7天）和增殖对照细胞中分别加入不同浓度的senolytic药物（Navitoclax、Venetoclax、PX-866、Bay80-6946）处理24小时，LDH检测显示这些药物剂量依赖性地杀死衰老细胞，其中Navitoclax在高浓度下也杀伤增殖细胞。相比之下，c-Myc过表达的ONS76细胞由于衰老细胞数量减少，对senolytics处理更为抵抗。这表明senolytics可有效清除放疗诱导的衰老髓母细胞瘤细胞。

在讨论部分，研究人员指出该研究首次报道了髓母细胞瘤细胞系中γIR介导的治疗诱导衰老。野生型p53对于衰老诱导至关重要，而p53突变细胞走向凋亡。c-Myc与p21的相互拮抗决定细胞命运：c-Myc过表达降低p21蛋白水平（不改变mRNA），从而抑制衰老并增加q-VD-OPh可抑制的细胞死亡。在临床意义上，由于p53野生型SHH髓母细胞瘤属中危组，放疗联合senolytics策略在改善预后和降低副作用方面具有潜力，尤其可能减少CSI剂量和清除SASP引起的微炎症。最后，研究人员将结论总结为：尽管研究结果来源于细胞系，但它们表明具有功能性野生型p53和低c-Myc表达的SHH活化髓母细胞瘤细胞在γIR暴露后发生细胞衰老；随后这些衰老细胞可被senolytic物质有效清除。将该策略转化到临床可能改善肿瘤学结局并抑制严重短期和长期副作用的发生。