VPS13A功能缺失突变导致细胞钙稳态紊乱并增加铁死亡易感性

《Neurobiology of Disease》：VPS13A loss of function mutations cause disruption of cellular calcium homeostasis and increase the vulnerability to ferroptosis

　　

摘要专业翻译 VPS13A病（VPS13A disease），既往称为舞蹈病-棘红细胞增多症（chorea-acanthocytosis），是一种由VPS13A基因常染色体隐性突变引起的超罕见神经退行性疾病，通常导致相应VPS13A蛋白的减少或缺失。该疾病与生活质量下降和预期寿命缩短相关。患者可能出现异常增多的棘红细胞（acanthocytes），并伴有神经系统症状，如癫痫发作、认知和行为缺陷，以及包括舞蹈症（chorea）、肌张力障碍（dystonia）或帕金森综合征（parkinsonism）在内的运动障碍，这些症状源于基底节（basal ganglia）的变性。VPS13A参与多种细胞通路，包括自噬、钙调控以及线粒体和内质网（endoplasmic reticulum, ER）功能的维持。近期，VPS13A被鉴定为桥样脂质转运蛋白家族（bridge-like lipid transfer protein, BLTP）的成员之一。BLTP定位于细胞器之间的膜接触位点（membrane contact sites），在此介导非囊泡性脂质转运。VPS13A已被鉴定存在于内质网与其他细胞器（如线粒体、脂滴、内体和质膜）之间的膜接触位点。膜接触位点具有多种功能。质膜-内质网接触位点（plasma membrane-ER contact sites, PMERCS）提供支架，允许在ER钙耗竭时钙离子跨质膜内流，这一过程称为钙池操纵性钙内流（store operated calcium entry, SOCE）。线粒体-内质网接触位点（mitochondria-ER contact sites, MERCS）是钙稳态、脂质转运和线粒体活性的核心调节者，而这些过程在神经退行性疾病中经常被破坏。在VPS13A缺陷的成纤维细胞和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的神经元中已报道SOCE降低。此外，研究人员在既往研究中描述了VPS13A病患者来源成纤维细胞中线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter, MCU）介导的线粒体钙缓冲能力改变，以及MERCS在钙应激下缺乏动态重组。迄今为止，线粒体的钙处理——特别是与受损SOCE相关联的方面——尚未在VPS13A缺陷的iPSC来源神经元中得到研究。因此，本研究的主要目标是确定VPS13A缺失在患者来源神经元的不同膜接触位点上的影响及其对钙稳态和细胞存活的细胞内后果。VPS13A缺失导致ORAI1蛋白表达降低、SOCE减弱以及PMERCS丰度减少，而线粒体钙负荷增加，可能是通过MCU的失调所致。此外，研究人员观察到脂质过氧化增加和对铁死亡（ferroptosis）的易感性增强。研究人员由此证明了SOCE之外细胞钙稳态的改变以及脂质过氧化，这些很可能导致VPS13A病中的神经元死亡。

论文解读

一、研究背景与科学问题

VPS13A病（VPS13A disease），既往称为舞蹈病-棘红细胞增多症，是一种由VPS13A基因常染色体隐性突变引起的超罕见神经退行性疾病，通常导致VPS13A蛋白的减少或缺失。该疾病与生活质量下降和预期寿命缩短相关，患者可出现棘红细胞增多以及癫痫、认知行为缺陷和运动障碍等神经系统症状，这些症状源于基底节变性。VPS13A参与自噬、钙调控以及线粒体和内质网功能维持等多种细胞通路。近期VPS13A被鉴定为桥样脂质转运蛋白家族成员，定位于内质网与线粒体、脂滴、内体和质膜等细胞器之间的膜接触位点，介导非囊泡性脂质转运。

膜接触位点具有多种功能。质膜-内质网接触位点提供支架，允许在ER钙耗竭时钙离子跨质膜内流，即钙池操纵性钙内流。线粒体-内质网接触位点是钙稳态、脂质转运和线粒体活性的核心调节者，这些过程在神经退行性疾病中经常被破坏。既往研究已在VPS13A缺陷的成纤维细胞和iPSC来源神经元中报道SOCE降低，并归因于钙释放激活钙通道蛋白ORAI1的下调。研究人员在前期研究中还描述了VPS13A病患者来源成纤维细胞中MCU介导的线粒体钙缓冲能力改变，以及MERCS在钙应激下缺乏动态重组。

然而，线粒体的钙处理——特别是与受损SOCE相关联的方面——尚未在VPS13A缺陷的iPSC来源神经元中得到研究。本研究的主要目标是确定VPS13A缺失在患者来源神经元的不同膜接触位点上的影响及其对钙稳态和细胞存活的细胞内后果。

二、研究内容与主要发现

研究人员利用来自3名无关健康供体的3个独立对照和2名VPS13A病且缺乏VPS13A/Chorein蛋白的非相关患者的smNPC分化获得腹侧中脑神经元培养体系，系统研究了VPS13A缺失对神经元钙稳态和细胞存活的影响。研究发现VPS13A缺失导致ORAI1蛋白表达降低、SOCE减弱和PMERCS丰度减少，而线粒体钙负荷增加，可能是通过MCU失调所致。此外，研究人员观察到脂质过氧化增加和对铁死亡的易感性增强。这些发现证明了SOCE之外细胞钙稳态的改变以及脂质过氧化，很可能导致VPS13A病中的神经元死亡。

三、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术方法：利用小分子神经元祖细胞（smNPC）分化获得腹侧中脑神经元培养体系，样本来源于3名无关健康供体和2名VPS13A病患者；通过Western blot检测VPS13A、STIM1和ORAI1蛋白表达水平；使用基于分裂荧光蛋白的接触位点传感器（SPLICS）标记并定量PMERCS和MERCS；运用Fluo-4, AM和Rhod-2, AM钙离子荧光染料结合活细胞超分辨显微成像分别检测胞质和线粒体钙水平；通过Bodipy 665/646染色评估脂质过氧化；采用AquaBluer细胞活力检测和碘化丙啶（PI）染色评估细胞死亡。

四、研究结果

3.1 VPS13A缺失导致SOCE减弱。 通过Fluo-4, AM钙成像检测发现，VPS13A病神经元中SOCE较对照神经元显著降低。Western blot分析确认VPS13A病神经元中ORAI1蛋白水平降低，而STIM1蛋白水平无变化。应用SERCA抑制剂毒胡萝卜素（thapsigargin）或ORAI1抑制剂BTP2处理对ORAI1和STIM1蛋白水平无影响。结果表明SOCE破坏是VPS13A缺陷中跨不同细胞模型的稳健表型，且SOCE减弱由ORAI1蛋白减少驱动。

3.2 VPS13A缺陷神经元的质膜-内质网接触位点被破坏。 通过SPLICS-PM-ER标记和免疫荧光染色发现，VPS13A神经元中每个细胞的SPLICS-PM-ER信号量较对照神经元减少，表明PMERCS丰度降低。ORAI1与STIM1的重叠面积在两组间无差异。STIM1在SPLICS-PM-ER处的信号强度无差异，但VPS13A神经元中ORAI1在SPLICS-PM-ER接触位点的信号强度较对照神经元升高。结果提示VPS13A病神经元的质膜-内质网接触位点可能较少，但ORAI1在这些接触位点更为集中。

3.3 VPS13A缺失导致线粒体钙负荷升高。 通过Fluo-4, AM检测发现VPS13A神经元与对照神经元的胞质钙负荷无显著差异，BTP2处理对两组胞质钙均无影响。通过Rhod-2, AM结合SPLICS-MT-ER标记的活细胞超分辨显微成像发现，VPS13A病神经元线粒体内及窄MERCS处的钙水平显著高于对照神经元。BTP2处理对对照神经元线粒体钙无影响，但显著降低了VPS13A病神经元的线粒体钙水平。结果表明VPS13A神经元线粒体钙水平升高，ORAI1抑制可特异性挽救这一升高，提示线粒体钙负荷改变可能与SOCE改变相关。

3.4 VPS13A缺陷神经元的线粒体钙摄取对MCU抑制剂Ru360不敏感。 在对照神经元中，离子霉素（ionomycin）和毒胡萝卜素均显著增加线粒体钙水平，毒胡萝卜素与Ru360联用可消除该效应，表明MCU是对照神经元线粒体钙摄取的主要通道。BTP2预处理24小时也可消除毒胡萝卜素效应，提示SOCE对维持ER钙水平至关重要。在VPS13A神经元中，离子霉素和毒胡萝卜素均引起线粒体钙水平显著升高，但毒胡萝卜素+Ru360与单独毒胡萝卜素处理的效果无差异，表明MCU对其抑制剂Ru360不敏感。结果提示VPS13A缺陷导致MCU对Ru360的敏感性丧失，MCU调控改变可能引起线粒体钙水平升高。

3.5 VPS13A缺陷神经元显示脂质过氧化增加和铁死亡易感性增强。 通过Bodipy 665/646染色发现，VPS13A神经元在基线条件下即显示升高的脂质过氧化，RSL3处理进一步加剧。AquaBluer细胞活力检测显示，RSL3处理对对照神经元活力影响轻微，而在VPS13A神经元中所有浓度的RSL3均引起细胞活力显著下降，Lip-1共处理可挽救。PI染色细胞死亡检测显示，RSL3在对照神经元中引起细胞死亡显著增加并被Lip-1有效挽救；在VPS13A神经元中，所有RSL3浓度均显著增加细胞死亡，Lip-1可挽救。结果证实VPS13A缺陷神经元脂质过氧化增加，对RSL3诱导的铁死亡更易感。

五、讨论与结论

研究人员提出，VPS13A缺失直接或间接破坏了多个膜接触位点处钙通道的调控和功能，从而损害细胞钙稳态。同时，过量的线粒体钙水平可能促进脂质过氧化，从而增加神经元对铁死亡性细胞死亡的易感性。关于VPS13A如何影响ORAI1功能，研究人员推测VPS13A作为BLTP参与质膜修复中的脂质转运，可能影响质膜脂质组成，从而影响ORAI1等离子通道的活性和稳定性。关于MCU失调机制，研究人员指出MICU1与Ru360竞争MCU上的相同相互作用位点，MICU1与MCU的准确位置依赖心磷脂结合，VPS13A缺失可能影响线粒体膜脂质组成，从而影响MICU1/MCU复合物的调控。研究局限性包括无法通过免疫荧光染色研究VPS13A与PMERCS或MERCS其他蛋白的共定位/相互作用。

研究结论：VPS13A功能缺失突变导致细胞钙稳态紊乱并增加铁死亡易感性。研究结果将细胞钙稳态的破坏与VPS13A病中的神经元变性联系起来，突显了异常钙信号作为神经元死亡的潜在汇聚驱动因素。