《Ecology and Evolution》：Confirmation of the Tibetan Brown Bear (Ursus arctos pruinosus) in Central Nepal Based on Genetic and Camera-Trap Evidence
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棕熊（*Ursus arctos*）在喜马拉雅地区以小而破碎的种群持续存续；然而，由于缺乏遗传学证据，其在尼泊尔的亚种身份和分布长期以来一直不确定。在此，研究人员将非侵入性遗传学分析与系统性相机陷阱调查相结合，以厘清尼泊尔跨喜马拉雅景观中棕熊的分类学地位，并记
棕熊（*Ursus arctos*）在喜马拉雅地区以小而破碎的种群持续存续；然而，由于缺乏遗传学证据，其在尼泊尔的亚种身份和分布长期以来一直不确定。在此，研究人员将非侵入性遗传学分析与系统性相机陷阱调查相结合，以厘清尼泊尔跨喜马拉雅景观中棕熊的分类学地位，并记录其在该地区的实际出现情况。研究人员于2022年至2024年间在道尔帕县（Dolpa District）和上木斯塘地区（Upper Mustang region）采集了粪便和毛发样本，并在上木斯塘（安纳布尔纳保护区，Annapurna Conservation Area）和道尔帕县开展了相机陷阱调查，作为更广泛的哺乳动物和雪豹调查的一部分。研究人员使用微卫星基因分型来识别独特个体并避免重复采样；然而，亚种水平的判定主要依赖于线粒体DNA（即控制区）的应用。研究人员基于与西藏棕熊（*Ursus arctos pruinosus*）和喜马拉雅棕熊（*U. a. isabellinus*）参考单倍型的序列相似性和系统发育聚类来确定亚种身份。研究人员发现，系统发育分析一致地将所有来自尼泊尔的样本置于西藏棕熊谱系内部，与来自青藏高原的参考序列形成一个支持良好的分支，从而提供了*U. a. pruinosus*在尼泊尔的首个遗传学确认。相机陷阱在海拔3834至4816米之间的三个不同站点记录了五次独立的捕获事件，并记录了熊在三种不同栖息地中的活动：高山草原、灌丛地和草地。研究人员从马纳斯鲁保护区（Manaslu Conservation Area）获得的一份经核实的摄影记录进一步支持了西藏棕熊在其主要遗传采样点之外的出现。这些发现为尼泊尔境内出现的棕熊建立了首个分子基线，并强调了其跨喜马拉雅景观作为全球罕见、且在该国被列为极度濒危的棕熊亚种外围栖息地的保护意义。
## 西藏棕熊在尼泊尔中部存在的遗传学与相机陷阱证据：研究解读
### 1. 研究背景与科学问题
棕熊（*Ursus arctos*）是全球分布最广的陆生哺乳食肉动物之一，横跨北美、欧洲和亚洲的多种栖息地类型。在亚洲，其分布范围延伸至喜马拉雅山脉和青藏高原，在海拔超过5000米的极端气候和生态条件下持续生存。尽管地理分布广泛，喜马拉雅地区的棕熊种群通常规模小、碎片化且文献记录匮乏，这主要归因于调查的后勤挑战、研究区域的偏远性以及长期监测能力的不足。在全球范围内， IUCN将棕熊列为“无危”（Least Concern）等级，但这种全范围状态掩盖了显著的区域性衰退和局部威胁。在亚洲的大部分分布区内，棕熊面临着栖息地破碎化、人兽冲突、基础设施发展和非法猎杀所带来的日益增长的压力。在尼泊尔，该物种被列为极度濒危（Critically Endangered），全国估计成熟个体不足20只，其分布高度受限且不连续，仅限于北部高喜马拉雅地区。
在喜马拉雅—西藏地区，通常认为存在两个棕熊亚种：喜马拉雅棕熊（*U. a. isabellinus*）主要局限于巴基斯坦和印度北部的西北喜马拉雅地区，而西藏棕熊（*U. a. pruinosus*）被认为分布于青藏高原及中国和尼泊尔毗邻的高海拔地区。线粒体DNA分析已证明，尽管地理上相近，西藏棕熊和喜马拉雅棕熊代表了遗传上截然不同的进化谱系，支持将其认定为独立亚种。然而在尼泊尔，许多历史记录仅依赖间接痕迹、当地报告或摄影证据，通常缺乏遗传学确认，这导致亚种身份的长期不确定性。近期相机陷阱调查改善了尼泊尔西北部棕熊出现的记录，并确认了该物种在极端海拔和干旱高山景观中的存在，包括呼姆拉县（Humla）等地。然而，来自尼泊尔中部（包括安纳布尔纳保护区内上木斯塘地区）的证据仍然有限，且在遗传水平上 largely 未经验证。这种确认的缺失阻碍了阐明*U. a. pruinosus*的分布边界和制定区域特异性保护策略的努力。
### 2. 研究目标与关键方法
### 2.1 研究设计
本研究旨在通过整合非侵入性遗传分析和系统相机陷阱调查，解决尼泊尔中部棕熊亚种身份不明的长期问题。研究区域位于尼泊尔西部跨喜马拉雅地区，涵盖木斯塘县（Mustang District，3573 km2）内的安纳布尔纳保护区（ACA，7629 km2）和道尔帕县（Dolpa District，7889 km2）内的谢-福克孙多国家公园（SPNP，3555 km2）。非侵入性遗传样本于2022年至2024年间在木斯塘县（ACA）和道尔帕县（SPNP）进行实地调查期间机会性采集，样本主要为推定棕熊粪便，偶尔有毛发样本。粪便样本使用无菌拭子从外层黏膜层采集并保存在InhibitEX缓冲液中，毛发样本使用消毒镊子采集并储存在纸质信封中。所有样本经GPS地理参照后在?20°C下储存。
### 2.2 关键分析技术
研究人员采用以下核心技术手段：
（1）**线粒体DNA控制区扩增与测序**：使用熊特异性引物扩增线粒体控制区（D-loop）短片段，遵循针对非侵入性样本降解DNA的PCR扩增和测序方案，序列使用MEGA v12进行编辑和比对。
（2）**系统发育分析**：采用最大似然法（Maximum Likelihood），在Kimura 2-parameter模型下推断系统发育关系，节点支持通过1000次自举重复评估。亚种身份基于与GenBank中*U. a. pruinosus*和*U. a. isabellinus*参考单倍型的序列相似性和系统发育聚类确定。
（3）**微卫星基因分型**：用于识别独特个体和避免重复采样，虽然亚种水平分配主要依赖线粒体DNA证据。
（4）**系统性相机陷阱调查**：在上木斯塘采用系统的4×4 km2网格设计，74个网格单元覆盖海拔3500–5600米范围。道尔帕县32个网格单元位于可比的高海拔栖息地。共部署96个相机陷阱站点（木斯塘64个，道尔帕32个），相邻站点最小间距2公里，不使用诱饵或气味引诱剂。相机安装在地面以上约40–50厘米处，沿野生动物路径、山脊线、谷底和自然移动走廊放置。
### 3. 主要研究结果
### 3.1 遗传样本回收与扩增成功率
研究人员在2022至2024年间从上木斯塘（n=6）和道尔帕县（n=4）共收集了10份推定棕熊的非侵入性遗传样本，包括7份粪便样本和3份毛发样本。其中7份样本成功获得线粒体DNA序列；4份样本通过微卫星标记成功基因分型。微卫星基因分型鉴定出两个独特个体：个体A在上木斯塘通过单份毛发样本（22CH01）检测到；个体B通过道尔帕采集的三份粪便样本（TN19、Sd70、Sd70Ly）识别，这些个体共享相同基因型。所有成功基因分型的个体均为雄性。总体微卫星基因分型成功率为40%（4/10样本），其中毛发样本成功率为33.3%（1/3），粪便样本成功率为42.9%（3/7）。
### 3.2 线粒体单倍型与亚种鉴定
从所有成功扩增样本获得的线粒体控制区序列一致，表明木斯塘和道尔帕的个体共享单一单倍型。单倍型多样性和核苷酸多样性均为零，表明所分析样本间不存在可检测的mtDNA变异。系统发育分析表明，所有尼泊尔棕熊序列均位于西藏棕熊谱系（*Ursus arctos pruinosus*）内部，与来自青藏高原的参考序列形成支持良好的分支。喜马拉雅棕熊（*U. a. isabellinus*）形成明显不同的姐妹谱系，与尼泊尔样本清晰区分。其他棕熊谱系也形成地理上独特的分支，懒熊（*Melursus ursinus*）作为外群。主要节点的自举支持值>70%，表明这些结论具有强大的系统发育支持。
### 3.3 上木斯塘和道尔帕相机陷阱证据
在部署的96个相机陷阱站点（木斯塘64个，道尔帕32个）中，木斯塘39个站点和道尔帕18个站点检测到哺乳动物，总采样努力为9336个相机陷阱夜（木斯塘6506个，道尔帕2830个）。上木斯塘所有棕熊检测均发生在海拔3834至4816米范围内，分布于高山草原、灌丛地和草地栖息地。采用间隔至少30分钟作为独立捕获事件的标准，研究人员在2023年4月至2024年6月间于上木斯塘三个相机站点记录了四次独立棕熊捕获事件。2023年4月30日在洛曼塘（Lomanthang）同一天检测到两次棕熊活动：清晨（06:33）向上坡移动，傍晚（17:58）向下坡移动；早晨期间还检测到五只家犬在附近，表明熊可能在白天隐蔽并在傍晚恢复移动。2023年6月5日在达莫达尔昆达（Damodar Kunda）记录到两次夜间连续检测（21:08和21:17），被视为一次独立捕获事件，观察到熊在相机附近玩耍并反复移动，包括在镜头前跳跃。2024年6月20日在洛曼塘记录到一次清晨检测（08:24），显示熊在相机前平静行走。
道尔帕县的相机陷阱作为长期雪豹（*Panthera uncia*）研究项目的一部分，在2023年3月3日至6月25日和2024年3月3日至10月25日两个调查期间运行。在道尔帕穆西村奇约尔（Chiyol, Musi village）记录到三次棕熊检测（2024年8月1日、9月3日和9月15日），海拔4167米，高山草原栖息地；2023年5月2日在道尔帕穆西村拉鲁（Laru, Musi village）记录到一次额外检测，海拔4940米，同样位于高山草原栖息地，个体在清晨（07:05）行走并短暂检查相机陷阱。
所有疑似棕熊图像一致显示大型熊类动物，具有浅至深棕色皮毛、明显的肩峰和凹形面部轮廓——这些都是棕熊的诊断性形态特征。IUCN物种生存委员会（SSC）熊类专家组（BSG）的专家独立审查了相关相机陷阱图像，基于皮毛颜色和质地、整体身体比例和颅面轮廓等诊断性形态特征，一致认为上木斯塘和道尔帕记录的熊与西藏棕熊一致。
### 3.4 额外活体目击记录
研究人员还从尼泊尔中部马纳斯鲁保护区萨姆多村（Samdo village）附近山上获得了一份可验证的活体棕熊摄影记录（28.6583321°N, 84.6486364°E）。照片由一名当地马主在寻找马匹时用手机拍摄，他最初注意到两只喜马拉雅秃鹫（*Gyps himalayensis*），随后在同一区域发现棕熊。图像显示一只棕熊正在进食尸体，表明存在 scavenging 行为或可能捕食大型哺乳动物。该个体表现出与西藏棕熊一致的形态特征，包括大体型、皮毛颜色和突出的肩部轮廓。
### 3.5 尼泊尔棕熊记录的空间分布
研究人员综合了所有数据，包括相机陷阱检测、遗传确认样本、经核实的活体目击记录以及已发表研究和科技报告中的记录，绘制了尼泊尔棕熊记录的当前分布图。这些汇编记录跨越2008年至2025年，始于上木斯塘地区首个已发表棕熊记录（Chetri 2008），代表了目前已知的尼泊尔棕熊分布。研究记录了棕熊在多个跨喜马拉雅景观中的出现，包括呼姆拉县利米谷（Limi Valley）、道尔帕县谢-福克孙多国家公园、安纳布尔纳保护区上木斯塘地区（木斯塘县）、马纳斯鲁保护区萨姆多村（廓尔喀县）以及坎钦琼加保护区杨马（Yangma，伊拉姆县）。结合IUCN红色名录评估的*Ursus arctos*全球分布范围，来自尼泊尔的确认记录主要落在该熊分布范围的中部和东部喜马拉雅部分。总体而言，这些记录证明棕熊出现在尼泊尔中部和西部的多个跨喜马拉雅景观中，这些区域似乎都代表了尼泊尔境内生态上适合棕熊的景观。
### 4. 讨论与结论
### 4.1 遗传确认的意义
该研究提供了尼泊尔西藏棕熊的首个遗传学确认证据。系统发育分析将所有尼泊尔样本明确置于西藏棕熊谱系内，与喜马拉雅棕熊谱系清晰分离，并具有强大的自举支持。这一遗传确认解决了关于尼泊尔跨喜马拉雅地区棕熊亚种身份的长期不确定性。此前，尼泊尔境内尚未开展棕熊遗传学研究，现有知识主要依赖间接痕迹、轶事相机陷阱图像、具有稀疏数据的栖息地模型和机会性目击。由于形态特征重叠和缺乏分子数据，这些研究无法区分亚种。该研究填补了喜马拉雅地区棕熊系统地理学中的一个关键地理和分类学空白，并解决了青藏高原南缘亚种边界附近的模糊性。
### 4.2 遗传多样性与种群隔离
所有成功扩增的木斯塘和道尔帕线粒体序列共享单一单倍型，导致单倍型和核苷酸多样性为零。虽然由于样本量有限应谨慎解释这一结果，但青藏高原及邻近地区的研究已记录了类似的低mtDNA变异模式，通常归因于历史瓶颈、长期隔离以及这些极端高海拔环境中受限的雌性介导扩散。微卫星扩增成功率较低（40%；4/10样本）代表了一个重要局限性。毛发样本的成功率尤其低（33.3%），可能源于毛囊组织量的差异、采集前的环境退化或跨喜马拉雅严酷条件（强烈太阳辐射、低湿度和大幅温度波动）下的长期暴露。此外，有限的样本数量减少了重复扩增和基因型验证的机会。仅鉴定出雄性个体与其他棕熊遗传调查结果一致，即雄性由于更大的家域范围和更强的扩散倾向而更常被检测到，而雌性表现出强烈的亲土性（philopatry）。这种性别偏倚的可检测性表明，雌性介导的基因流在尼泊尔可能特别有限，可能加剧遗传隔离或来自西藏的季节性迁移。
### 4.3 相机陷阱与遗传发现的关联
上木斯塘的相机陷阱记录为遗传数据提供了独立的生态学佐证，证实了西藏棕熊在尼泊尔中部的存在。2023至2024年间在三个站点记录的4次捕获事件记录了海拔3834至4816米间高山草原、灌丛地和草地栖息地的熊活动。这些栖息地类型和海拔范围与青藏高原其他地方报道的西藏棕熊密切匹配，加强了遗传鉴定。观察到的行为，包括夜间活动、局部移动和对家犬的明显回避，与人类改造的高山景观中棕熊的生态学一致。相机陷阱和遗传数据的整合增强了研究者对照片记录代表*U. a. pruinosus*而非形态相似的喜马拉雅棕熊的信心。
### 4.4 分布影响与外围种群
综合来看，来自道尔帕和上木斯塘的遗传记录，以及来自利米谷、马纳斯鲁保护区和尼泊尔东部的相机陷阱检测和经核实的目击记录，表明西藏棕熊在尼泊尔跨喜马拉雅景观中以孤立的斑块网络持续生存。然而，相对于IUCN定义的*Ursus arctos*全球分布，所有尼泊尔记录都发生在青藏高原种群的南部边缘，突显了其作为分布范围边缘的外围种群地位。外围种群通常表现出降低的遗传多样性和对环境变化、人类干扰和人口统计随机性的更高脆弱性。尼泊尔西藏棕熊种群可能代表了青藏高原主要种群的较小、半隔离延伸，这可能在未来气候变化情景下作为重要的踏脚石或避难所栖息地。然而，尼泊尔适宜栖息地的破碎化性质，加上日益增加的基础设施发展、牲畜放牧和人熊冲突，可能进一步威胁这些小而孤立种群的持续生存。
### 4.5 保护意义与研究展望
尼泊尔西藏棕熊的遗传确认为理解该亚种在其已知分布范围南缘的分布和保护状况提供了重要基线信息。作为国家极度濒危的分类群，西藏棕熊需要针对其受限分布、低遗传多样性和栖息地破碎化量身定制的保护策略。研究数据确认了尼泊尔至少存在两只雄性西藏棕熊，但未提供常驻繁殖种群的直接证据。由于雄性棕熊通常表现出比雌性更大的家域范围和更强的扩散倾向，尼泊尔检测到的某些个体可能代表来自青藏高原邻近种群的扩散或 transient 个体。然而，跨越多年和多个地点（包括木斯塘、道尔帕、呼姆拉、马纳斯鲁和尼泊尔东部）的重复棕熊记录表明，尼泊尔的跨喜马拉雅景观被棕熊定期使用，而非孤立的偶然观察。无可检测的线粒体变异和种群隔离的证据突显了维持跨喜马拉雅走廊景观连通性的紧迫性，包括减少人为影响。
如果西藏棕熊被确认在尼泊尔维持常驻种群并繁殖，保护优先事项应包括保护关键高山栖息地、维持景观连通性以及缓解牧区人熊冲突。反之，如果尼泊尔主要作为来自更大青藏高原种群的个体的季节性移动走廊或外围栖息地，保护工作对于维持栖息地连通性和支持种群交流仍然很重要。未来的保护和研究优先事项可能包括扩展非侵入性遗传采样至更多区域（特别针对雌性和繁殖证据）、纳入核基因组标记以评估连通性和有效种群规模，以及缓解牧区景观中的人熊冲突。该研究为尼泊尔西藏棕熊建立了首个分子基线，为未来保护规划提供了初步基础，并强调了整合多种方法论（包括遗传学、相机陷阱和当地生态知识）来研究具有大空间需求的难以捉摸物种的重要性。长期监测对于阐明种群规模、繁殖状态以及尼泊尔与青藏高原种群之间的连通程度至关重要。与青藏高原邻近地区的跨界合作，特别是与中国的研究和保护专业人员合作，将对于确保这一全球罕见亚种在尼泊尔的长期持续生存至关重要。
### 5. 研究结论
该研究基于线粒体单倍型分析和多年相机陷阱数据，提供了尼泊尔中部西藏棕熊（*Ursus arctos pruinosus*）的首个遗传学确认记录。系统发育分析一致地将所有尼泊尔样本置于西藏棕熊谱系内，与青藏高原参考序列形成支持良好的分支，而喜马拉雅棕熊谱系则清晰分离。相机陷阱在海拔3834至4816米之间记录了棕熊在多种高山栖息地中的活动，IUCN熊类专家组专家基于形态特征独立确认了亚种身份。马纳斯鲁保护区的额外摄影记录进一步支持了西藏棕熊在中部尼泊尔的持续存在。这些发现建立了尼泊尔棕熊的首个分子基线，确认了跨喜马拉雅景观作为这一全球罕见且国家极度濒危亚种外围栖息地的保护意义，并填补了棕熊系统地理学在喜马拉雅地区的关键空白。研究同时强调了低遗传多样性、可能的种群隔离以及跨喜马拉雅走廊连通性保护的重要性，为未来保护规划提供了基础框架。
