《Ecology and Evolution》：Coat Color-Associated Transcriptomic Differences of Black and White Hortobágyi Racka Sheep Using the RNA-Seq Technique
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毛色是绵羊重要的可见表型，并可能反映色素沉着相关分子调控的潜在差异。然而，Hortobágyi Racka绵羊黑白毛色分歧背后的转录组机制仍未得到充分表征。为此，该研究采用高通量RNA测序（RNA-Seq）分析黑色和白色被毛Hortobágyi Racka绵羊
毛色是绵羊重要的可见表型，并可能反映色素沉着相关分子调控的潜在差异。然而，Hortobágyi Racka绵羊黑白毛色分歧背后的转录组机制仍未得到充分表征。为此，该研究采用高通量RNA测序（RNA-Seq）分析黑色和白色被毛Hortobágyi Racka绵羊的皮肤转录组图谱，并鉴定与毛色差异相关的功能通路。研究人员在黑色被毛绵羊与白色被毛绵羊比较中鉴定出108个差异表达基因（DEGs）；其中25个下调、83个上调（FC > 1.5，p < 0.05），最显著的基因包括TYRP1、PMEL、TRPM1、MLANA、SLC24A4、SLC45A2、DCT、OCA2和DDC（padj < 0.05）。总体而言，GO、KEGG和PPI分析一致表明，Hortobágyi Racka绵羊的毛色分歧主要与黑色素生成（melanogenesis）、黑素体生物学（melanosome biology）和酪氨酸代谢（tyrosine metabolism）相关，同时也提示可能与氧化还原平衡、能量代谢和应激反应相关的更广泛细胞过程存在联系。然而，这些更广泛的适应性解释应被视为假设生成性，并需要利用更大队列、表型测量和功能测定进一步验证。研究人员的研究提供了连接毛色表型与色素调控网络的转录组框架，并为研究绵羊毛色变异的可能适应性意义提供了基础。
一、研究背景与问题
毛色是绵羊重要的可见表型，其基础黑色素（melanin）合成受复杂基因网络调控，并整合多种信号和代谢通路。除色素沉着外，黑色素还具有吸收紫外线（UV，ultraviolet）辐射、减轻UV诱导的皮肤细胞损伤、清除自由基和调节光敏性等保护作用。真黑色素（eumelanin）和褐黑色素（pheomelanin）的比例与分布决定反刍动物被毛颜色；真黑色素含量较高产生深色，褐黑色素含量较高产生浅色。两者均源自多巴醌（dopaquinone），但褐黑色素合成更依赖抗氧化剂，消耗更多谷胱甘肽/半胱氨酸，可能降低抗氧化能力并影响环境应激恢复。在全球气候变化导致热应激风险增加的背景下，家畜毛色与热应激适应的关系受到关注。然而，现有证据并不支持某种毛色具有普遍最佳气候适应性：不同研究对浅色与深色被毛优势的结论不一致，且适应性受环境压力、品种历史和毛发/羊毛特征等影响。Hortobágyi Racka（Ovis aries strepsiceros hungaricus）是匈牙利独特地方品种，以螺旋V形角著称，常因耐极端夏冬条件用于杂交。该品种主要有纯白和纯黑两种毛色，适合研究毛色。Zsolnai 等（2020）报道该品种两种表型在遗传特征上存在差异，可能与应激适应有关，包括基于50 K SNP基因分型中HTR5A内SNP的推定选择信号。当前问题在于，Hortobágyi Racka绵羊黑白毛色分歧的转录组机制尚未充分表征。该研究旨在用RNA-Seq分析黑白被毛Hortobágyi Racka绵羊皮肤毛色相关转录组差异，表征色素差异的分子通路，并探索其与细胞应激适应的潜在联系。
二、研究开展、结论与意义
研究人员采集10只Hortobágyi Racka母羊（白5只、黑5只），年龄和体重相似，饲养环境与饲养管理一致，采样来自匈牙利Hortobágyi Nonprofit Kft.，并于2023年5月在Tomajmonostora屠宰场采集后颈皮肤。研究利用高通量RNA-Seq比较黑白被毛绵羊皮肤转录组，鉴定108个DEGs，其中黑色被毛较白色被毛有25个下调、83个上调，最显著上调基因包括TYRP1、PMEL、TRPM1、MLANA、SLC24A4、SLC45A2、DCT、OCA2和DDC。GO、KEGG和PPI分析一致显示毛色分歧主要与黑色素生成、黑素体生物学和酪氨酸代谢相关，同时提示与氧化还原平衡、能量代谢和应激反应等更广泛细胞过程存在可能联系。结论认为，该研究提供了连接毛色表型与色素调控网络的转录组框架，并为研究绵羊毛色变异可能适应性意义提供基础；但更广泛适应性解释属假设生成，需更大队列、表型测量和功能测定验证。
三、主要关键技术方法
研究使用10只Hortobágyi Racka母羊（白5只、黑5只，1.5–2岁，50–60 kg），样本队列来自匈牙利Hortobágyi Nonprofit Kft.，于2023年5月在Tomajmonostora屠宰场采集后颈皮肤并RNAlater保存。提取总RNA后，用QuantSeq 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit构建文库，在Illumina NovaSeq 6000测序，采用2×151配置，但仅保留Read 1并修剪至75 bp。序列经BBDuk质控，STAR比对到绵羊ARS-UI_Ramb v3.0参考基因组，HTSeq计数，edgeR TMM归一化，limma voom建模，以毛色为主效应鉴定DEGs（FC > 1.5，p < 0.05，p
adj < 0.05）。DAVID进行GO/KEGG富集，STRING构建PPI网络，qRT-PCR验证10个基因，GAPDH为内参，采用2
?ΔΔCt法分析。
四、研究结果
3.1 比对后的RNA-Seq数据：研究从9只动物（1只黑色被毛动物未能测序）通过Illumina NovaSeq 6000产生54,017,887条reads，并成功注释到Ovis aries基因组的21,328个基因。由于QuantSeq 3′文库结构和单端75 bp读长，预期在多重复区域和旁系同源皮肤表达基因家族中存在较高多比对。HTSeq基因水平定量时未将模糊分配reads计入基因总数，以减少多比对造成的膨胀。结果表明黑白被毛样本的比对统计总体可用于后续差异表达分析。
3.2 黑白被毛Hortobágyi Racka羊之间的DEGs：基于FC > 1.5和p < 0.05阈值，研究鉴定108个DEGs，其中25个下调、83个上调。下调DEGs涉及表皮分化与屏障、组织组织、应激响应与调控信号、离子通道相关信号及部分未表征位点。上调DEGs以保守色素网络为主，包括黑色素生成酶、黑素体结构、黑素体运输和上游黑色素细胞调控基因，与色素合成和沉积的协调调控一致。其他上调DEGs涉及细胞信号和应激反应、膜运输和通道处理、脂质/氧化还原和上皮屏障相关代谢、组织组织通路及髓鞘相关转录本。多重检验FDR显示TYRP1、PMEL、TRPM1、MLANA、SLC24A4、SLC45A2、DCT、OCA2和DDC显著上调（p
adj < 0.05）。
3.3 富集与通路分析：合并上下调DEGs得到12个显著功能注释；上调DEGs得到11个，下调DEGs得到2个显著功能注释。KEGG分析在所有DEGs中鉴定6个显著富集通路，包括氧化磷酸化、酪氨酸代谢、代谢通路、产热、黑色素生成和阿尔茨海默病。分开分析时，上调DEGs富集相同通路但除外氧化磷酸化，下调DEGs无显著富集通路。GO基因-术语网络显示以色素和黑素体相关过程为中心，TYR、TYRP1、OCA2、DCT、PMEL、MLANA、SLC24A5和RAB32贡献多个连接GO术语，并有离子转运相关小模块。STRING PPI识别出以TYR–DCT–MLANA为中心的黑色素生成相互作用模块，并通过SLC45A2和DDC连接黑素体运输；其他组件涉及线粒体/氧化还原代谢和细胞周期/蛋白稳态信号。结果说明毛色差异不仅涉及色素产生，还伴随离子转运、氧化还原、线粒体代谢和蛋白稳态相关转录差异。
3.4 RNA-Seq数据的RT-qPCR验证：研究选择10个DEGs，包括皮肤色素沉着相关基因（TYRP1、SLC24A5、PMEL、TYR）、免疫功能相关基因（IRF4、PLXNC1、GPNMB）和代谢通路相关基因（TRPM1、VNN1、PLP1），在黑白Hortobágyi Racka羊皮肤中进行RT-qPCR验证。结果显示，10个基因中有8个在黑色羊皮肤中较白色羊皮肤显著高表达（p < 0.05），与转录组测序数据一致；两组间最显著的基因表达变异为TYRP1。该验证支持RNA-Seq所揭示的毛色相关转录差异。
五、讨论部分总结
讨论指出，该研究样本量n = 9（4 vs 5）适中，与Vasu 等（2024）在Changthangi与Muzzafarnagri羊皮肤转录组分析相当；同品种内对比不同毛色表型可限制品种水平遗传结构混杂。该研究鉴定的DEG数量低于Xiong 等（2019）和Yao 等（2019）报道的山羊和绵羊皮肤转录组研究，但略高于Peng 等（2018）在莱芜黑山羊和鲁北白山羊中的研究。黑色被毛羊较白色被毛羊上调基因更多，且转录组以色素和黑色素生成相关基因过表达为特征，这些基因在先前绵羊色素研究中也有发现，低表达与较浅毛色和/或皮肤表型相关。部分显著上调基因还涉及家畜适应和免疫，如TRPM1、TYRP1和SLC家族基因。GO富集和GO基因-术语网络显示钙、钾:钠反向转运体活性和钙通道活性富集，可能反映黑色素细胞/黑素体生理增强；氧化还原酶活性富集也与色素合成的氧化还原需求和活性氧（ROS，reactive oxygen species）生成相关。STRING结果提示黑色素生成与细胞应激反应通路之间可能存在网络水平关系，但不提供应激适应的直接功能证据。KEGG结果明确色素核心与更广泛代谢/线粒体适应轴，但应解释为线粒体和代谢通路的协调转录差异证据，而非直接应激生理和适应证据。阿尔茨海默病通路富集不应单独解释为神经退行性病理，可能反映广泛细胞应激程序。讨论还涉及黑色素细胞与免疫、皮质醇/下丘脑-垂体-肾上腺（HPA，hypothalamic–pituitary–adrenal）轴、阿黑皮素原（POMC，proopiomelanocortin）及真黑色素抗氧化保护等可能联系，但强调这些为假设生成。局限性包括样本量有限，未包括直接表型关联或耐热性、UV反应、氧化应激状态、皮肤温度、体温调节能力等物理测量，RT-qPCR仅验证转录变化，未在蛋白、生化或生理水平验证，因此不宜推断因果。
六、研究结论翻译
黑白被毛Hortobágyi Racka绵羊之间的转录组差异以强色素特征为主，涉及关键黑色素生成、黑素体和酪氨酸代谢基因，如TYRP1、PMEL、TRPM1、MLANA、SLC24A4、SLC45A2、DCT、OCA2和DDC。此外，功能富集、GO基因-术语网络和PPI网络分析提示，毛色相关表达差异不仅限于色素产生；离子转运、氧化还原酶活性、线粒体代谢、氧化磷酸化、产热和蛋白稳态相关组件的富集表明，活跃黑色素生成可能伴随氧化还原平衡、细胞器稳态、细胞生物能量学和应激反应生理的广泛变化。这些发现支持以下假设：绵羊皮肤色素可能通过多效性效应与适应性细胞过程生物学相关，尤其与光保护、氧化应激缓冲和线粒体功能相关。总体而言，该研究提供转录组证据，表明Hortobágyi Racka绵羊毛色分歧主要与色素和黑素体相关基因表达有关，而观察到的应激相关分子通路富集可能提示与细胞应激反应的潜在联系。这一解释仍为假设生成性，为未来在更大且环境特征明确群体中进行功能验证提供基础。
