单细胞多组学揭示幼年特发性关节炎滑液免疫细胞图谱

《European Journal of Immunology》：Synovial Fluid Immune Cell Landscape in Juvenile Idiopathic Arthritis

专业摘要翻译 幼年特发性关节炎（JIA）是一种常见的儿童炎症性风湿病，但其驱动关节免疫激活的机制仍不清楚。本研究采用两种互补的方法——单细胞多组学和流式细胞术，分析了JIA患者的滑液（SF）免疫细胞。与血液相比，SF呈现出显著改变的免疫景观。髓样树突状细胞和浆细胞样树突状细胞均在SF中富集，且SF单核细胞表现出巨噬细胞分化的迹象。B细胞在SF中极为罕见，存在的少数B细胞主要为CD21lo年龄相关B细胞（ABC）。相比之下，CD56hiCD16?自然杀伤（NK）细胞和CD161?γδT细胞在SF中高度富集。在SF的CD4+T细胞中，调节性T细胞（Treg）、外周辅助T细胞（Tph）和CD161+T细胞最为丰富，而CD8+T细胞则呈现组织驻留记忆表型，广泛表达多种颗粒酶。SF中的免疫细胞频率与匹配的血液样本相关性较差，且未检测到SF免疫细胞组成与JIA亚型或选定临床参数之间的明确关联。这一对SF免疫环境的全面描述为未来旨在确定特定免疫细胞亚群在JIA发病机制中作用的研究奠定了基础。

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研究背景与目的

幼年特发性关节炎（JIA）是儿童最常见的炎症性风湿病，全球影响超过200万儿童。尽管其发病率高，但驱动关节内免疫激活的潜在机制仍不清楚。目前JIA依据国际风湿病学会联盟标准分为七种亚型，其中最常见的是少关节炎型和类风湿因子阴性多关节炎型，两者共同占所有JIA病例的70%-90%，且具有显著的临床和遗传相似性，被认为可能代表同一疾病谱系。高达60%的患者抗核抗体（ANA）阳性。在疾病发作期间，炎性关节中会积聚滑液（SF），临床上常在注射皮质类固醇前进行常规抽吸。近期研究表明，SF的免疫细胞组成在一定程度上反映了滑膜组织（ST）的组成，尤其对于T细胞而言。因此，SF可能成为研究JIA免疫发病机制的易获取样本来源，其免疫细胞图谱也可能具备预测治疗反应的生物标志物潜力。然而，此前仅有少数现代高维单细胞研究探索了JIA SF的免疫细胞组成。

研究方法

研究人员采用BD Rhapsody单细胞分析系统对来自6名活动性滑膜炎JIA患者的7250个滑液单个核细胞（SFMC）和2名患者的2336个外周血单个核细胞（PBMC）进行了靶向基因表达（473个基因）和表面蛋白表达（45种表面蛋白）整合的单细胞多组学分析。随后，研究人员在一个包含30份SF和22份血液样本的更大队列中，利用流式细胞术对发现进行了验证和扩展。所有样本均采集自2022年至2024年间芬兰库奥皮奥和图尔库大学医院收治的JIA患儿，患者均为初诊或复发的活动性滑膜炎，且在采样前至少2个月未使用免疫调节药物。

研究结果

2.1 滑液与血液包含所有主要免疫细胞亚群

通过无监督聚类，SFMC和PBMC共产生9个元簇，代表经典免疫细胞亚群，包括单核细胞/巨噬细胞、两种常规树突状细胞亚群（cDC1和cDC2）、浆细胞样树突状细胞（pDC）、B细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞、γδ/非传统T细胞（γδ/UCT）以及NK细胞。所有主要谱系在SF和血液中均有检出，但相对丰度不同。

2.2 单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞亚群在滑液中富集

对单核/巨噬细胞和DC元簇重新聚类得到5个新簇。SF中的单核细胞/巨噬细胞上调了慢性炎症相关组织巨噬细胞的转录本（如FN1、SPP1、CXCL10），而血液中则富集循环单核细胞转录本（如CD48、SELL、S100A12）。pDC、cDC1和cDC2均在SF中更丰富。此外，SF中唯一检测到一个表达CCR7和LAMP3的DC亚群。流式细胞术验证了这些发现，并显示SF中CD14⁺CD16^?单核细胞/巨噬细胞CD14表达降低、HLA-DR表达升高，表明其在炎症关节环境中呈现更活化的表型。

2.3 滑液中罕见的B细胞高度分化并富集CD11c⁺CD21^lo年龄相关B细胞

B细胞在SF中的频率远低于血液（平均为总CD45⁺细胞的1.3% vs. 9.0%）。血液B细胞主要为IgD⁺CD27^?幼稚B细胞，而SF B细胞则富集于缺乏IgD、IgM和CD21但表达CD11c/ITGAX的簇，符合年龄相关B细胞（ABC）的表型。流式细胞术证实，SF中IgD^?CD27⁺转换记忆B细胞和IgD^?CD27^?双阴性B细胞比例更高，而过渡性幼稚B细胞几乎缺失，ABC显著富集。

2.4 CD56^hi NK细胞和CD161阴性γδ T细胞在滑液中富集

对T细胞和NK细胞元簇重新聚类得到13个簇。NK细胞簇7（CD56^hiCD16^?）在SF中富集，而簇9（CD56^loCD16⁺）在血液中富集。流式细胞术验证了CD56^hiCD16^?和CD56^hiCD16⁺ NK细胞亚群在SF中更丰富，而CD56^loCD16⁺ NK细胞在SF中几乎不存在。同时，CD161^? γδ T细胞在SF中显著富集。

2.5 CD4⁺T细胞在滑液中富集调节性和外周辅助T细胞，而CD8⁺T细胞呈现组织驻留效应记忆表型

CD4⁺T细胞中，调节性T细胞（Treg）、外周辅助T细胞（Tph）和CD161⁺记忆CD4⁺T细胞在SF中高度富集，而幼稚CD4⁺T细胞和滤泡辅助T细胞（Tfh）几乎缺失。CD8⁺T细胞中，一个组织驻留记忆表型的簇（表达PD-1、CD69、ITGAE及多种颗粒酶转录本）在SF中高度富集，而幼稚和TEMRA CD8⁺T细胞则在血液中更丰富。

2.6 滑液免疫细胞频率与临床参数及血液免疫细胞频率相关性差

探索性分析未发现SF免疫细胞频率与JIA亚型、ANA状态、年龄、性别、葡萄膜炎、红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）及幼年关节炎疾病活动评分10（JADAS10）等临床参数之间存在明确关联。此外，除少数细胞类型外，SF与血液中大多数免疫细胞亚群的频率无显著相关性。

讨论与结论

本研究全面描绘了JIA患者SF相对于外周血的免疫细胞组成特征。SF中的髓系和DC亚群、CD56^hi NK细胞、CD161^? γδ T细胞、Treg、Tph细胞以及组织驻留记忆CD8⁺T细胞均呈现富集，而B细胞特别是幼稚B细胞显著减少，残余B细胞多为ABC。这些发现与既往研究一致，并进一步证实了SF是一个有别于血液和ST的独特标本类型。研究未发现SF免疫细胞组成与JIA亚型或临床活动性参数之间的强关联，这支持了少关节型和多关节型JIA可能属于同一疾病谱系的观点。该研究的优势在于较大的样本量（n=30）以及结合单细胞多组学与流式细胞术的互补策略。研究结论指出：本研究对JIA SF免疫环境进行了全面描述，为未来阐明特定免疫细胞亚群在JIA发病机制中的作用及指导生物标志物发现奠定了基础。