热蛋白质组分析（TPP）结合分子对接鉴定恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）新药物靶点并改进膜蛋白靶点检测

《Molecular & Cellular Proteomics》：Thermal proteome profiling identifies new drug targets in Plasmodium falciparum parasites

临床使用抗疟药耐药性的蔓延增加了发现新药物靶点的需求。在此，研究人员筛选了25种作用机制（MoA）已知和未知的抗疟药，以验证恶性疟原虫（P. falciparum）中的旧药物靶点并发现新药物靶点。通过结合全蛋白质组细胞热位移分析（CETSA）的实验方法与分子对接的计算过滤，研究人员发现这些药物可与先前已知的药物靶点结合，验证了ACS10是MMV665915的靶点，并发现了新的药物靶点。此外，研究人员通过纳入膜增溶步骤更新了实验和分析MS-CETSA流程，在细胞裂解物和完整细胞中验证了atovaquone和cipargamin的靶点，并绘制了寄生虫对这些抗疟药的响应。

该研究由Samuel Pazicky、Jerzy M. Dziekan、Seth Tjia、Selina Bopp、Dyann Wirth、Peter R. Preiser和Zbynek Bozdech完成。疟疾在2024年仍有近3亿病例和60多万死亡，是全球公共卫生威胁。青蒿素联合疗法（ACT）自本世纪以来在降低疟疾相关死亡中起重要作用，但恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）对青蒿素及多数配伍药物产生耐药，东南亚2009年出现耐药，撒哈拉以南非洲近期出现，强调需要替代化疗药物。发现新药和新靶点是全球疟疾控制与消除规划的优先事项。历史上多数抗疟药来自大规模表型筛选，作用机制（MoA）未知；少数直接靶点已被发现，如二氢叶酸还原酶（DHFR，proguanil和pyrimethamine靶点）、二氢蝶酸合酶（DHPS，sulfadoxine靶点）和线粒体bc₁复合物（atovaquone靶点）。当前药物发现常从高通量表型筛选（HTS）开始，但更重视后续MoA和药物靶点鉴定。体外进化与全基因组分析（IVIEWGA）是解析新抗疟化合物MoA的金标准，但存在抗性机制突变、适应度补偿因素、无法获得抗性寄生虫等挑战。热蛋白质组分析（TPP）或细胞热位移分析（CETSA）基于药物结合使靶蛋白更耐热聚集的生物物理现象，结合质谱（MS）定量蛋白质组学可全蛋白质组发现直接蛋白-药物结合。研究人员此前已将CETSA引入恶性疟原虫药物靶点鉴定，并可在总蛋白裂解物（lysate CETSA）或红细胞宿主内完整细胞（in-cell CETSA）中检测，交叉参考可高置信预测靶点相互作用。因此，研究人员应用CETSA筛选25种抗疟化合物，并进行方法优化。

为开展研究，关键方法包括恶性疟原虫3D7体外培养、裂解物和完整细胞CETSA、去垢剂辅助CETSA（DACETSA）、蛋白质组整体溶解度改变（PISA）、TMT（tandem mass tag）标记定量质谱、ITDRMS生物信息学分析、分子对接和DIA-NN数据分析等。人血来源为Nanyang Technological University Institutional Review Board批准项目IRB-2021-1015，依据Singapore Human Biomedical Research Act 2015 rev 2020。检测中利用剂量反应曲线和置信指数判定命中，PISA以经验贝叶斯调节模型分析。

结果部分，利用改进的生物信息学流程（ITDRMS）鉴定恶性疟原虫推定药物靶点。研究人员对25种作用机制已知或未知的抗疟药进行裂解物ITDR（isothermal dose response）CETSA。共3850个寄生虫蛋白可拟合剂量反应曲线，ITDRMS较mineCETSA能剔除由最低或最高药物剂量离群值驱动的假阳性热位移，并去除在不同温度同时稳定和去稳定的模糊命中，同时保留严格截断排除的潜在靶点。最终鉴定39个高置信命中（置信指数>1，响应>1）和75个候选（置信指数>0.75，响应>0.5）。多数化合物仅稳定1-6个蛋白，MMV666070和MMV007695分别稳定21和49个蛋白。ITDRMS重现已知结合：cladosporin靶点赖氨酰tRNA合成酶、MMV000848靶点PfPNP、falcilysin与MMV000848和MMV665806。还发现PfHsp90、plasmepsins I和II、ACS10等。MMV665915仅稳定ACS10；ACS10条件敲低寄生虫在低aTc下对MMV665915更敏感（EC₅₀=0.09 μM vs 0.20 μM vs 野生型0.37 μM），ACS10-M300I突变体EC₅₀升高，验证ACS10为靶点。还发现DPH5、TIM50、PfLDH、ENT1、MFR4、核苷酸转移酶、DDX41等。

分子对接预测靶酶竞争性抑制。为支持CETSA结合证据，研究人员用分子对接优先选择候选。去除大型蛋白复合物亚基后，对78个蛋白与相应化合物对接。47个可找到相似实验配体结合结构（一致性>25%）。红对接在74%结构中正确识别结合口袋。用5个及以上pose位于结合口袋作为高置信，将推定靶点缩小到14个蛋白，包括plasmepsin I、plasmepsin II、Hsp90、DPH5、ENT1、LDH、核苷酸转移酶等；对接还提示endoplasmin、glutamyl-tRNA synthetase、hexose transporter、methionyl-tRNA synthetase等结合。

去垢剂辅助增溶提高恶性疟原虫膜蛋白检测。原CETSA流程避免去垢剂，膜蛋白检测不足，初始筛选未检出PfATP4。研究人员建立DACETSA，在裂解物和完整细胞中用NP40或DDM/CHS增溶，并引入SP4蛋白提取。与标准流程相比，DDM/CHS或NP40在裂解物中平均额外检测358和146个寄生虫蛋白，在完整细胞中额外检测888和796个；还增加人红细胞蛋白检测。基因本体（GO）分析显示，DACETSA扩展了内质网、apicoplast、线粒体等膜富集细胞器及Mauer’s clefts的蛋白检测，并鉴定更多独特肽段。

DACETSA鉴定可溶性和膜蛋白药物靶点。去垢剂未阻止可溶性靶点鉴定。pyrimethamine处理中PfDHFR-TS在裂解物（DDM/CHS和NP40）中为最稳定蛋白，完整细胞中也有热稳定但置信较低。DSM705和DSM265在裂解物DACETSA中稳定PfDHODH。MMV1576856（cipargamin外消旋混合物）在裂解物和完整细胞中稳定PfATP4，完整细胞中为最高命中；完整细胞GSEA显示转录和翻译相关因子，核糖体与T复合物去稳定，翻译起始及调控蛋白稳定，提示核糖体停滞。atovaquone在裂解物中稳定9个检出bc₁复合物亚基中的4个，其中2个为最高命中；完整细胞中稳定7个检出亚基中的4个，其中2个为最高命中。GSEA显示atovaquone稳定呼吸复合物III及一般膜整合蛋白，去稳定三羧酸（TCA）循环和次级代谢物合成。MCP2在裂解物和完整细胞中均为最强稳定蛋白之一；PISA中MCP2是唯一显著命中，溶解度较对照或DSM265处理增加约1.7倍。

讨论部分，CETSA筛选重现已知靶点，增强结果可信度。plasmepsins I和II可能是高丰度脱靶，掩盖真正靶点（可能plasmepsins IX或X）。MMV007695和MMV666070稳定大量蛋白，前者预测溶解度最低且含phthalimide亚结构，可能非特异性反应，二者结果需谨慎解释。蛋白质组范围检测常揭示比预期更复杂的药物相互作用，存在脱靶、假阳性和假阴性；命中排名取决于蛋白可稳定程度，阶段特异性也可能影响。ITDRMS和分子对接用于减少假阳性，最终将主要命中缩小到14个蛋白。DPH5、ENT1、LDH、核苷酸转移酶等具有潜在靶点价值；39个稳定蛋白因缺乏同源结构无法评估。膜增溶步骤使线粒体复合物III和PfATP4分别被atovaquone和cipargamin验证。MCP2可能部分定位线粒体膜并转运atovaquone，但需进一步实验确认。完整细胞中，atovaquone响应较特异，抑制电子传递链导致TCA循环停滞和次级代谢物合成下降，并可能启动转录响应；cipargamin响应更大且不特异，符合快速作用，抑制翻译起始并形成应激颗粒，蛋白酶体稳定，蛋白稳态严重失调。结论翻译：总之，研究人员结合实验（CETSA）和计算（对接）方法，鉴定了所筛选化合物的多个候选药物靶点。在原有流程基础上，研究人员改进并提高了裂解物和完整细胞中膜蛋白靶点的鉴定能力，验证了atovaquone和cipargamin的作用机制，并额外绘制了它们对活寄生虫的影响。