临床单细胞蛋白质组学样本保存策略的系统评估

《Molecular & Cellular Proteomics》：Benchmarking sample preservation strategies for clinical single-cell proteomics

单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics，SCP）能够直接在蛋白质组分辨率下表征细胞状态，但由于样本采集、储存和运输方面的挑战，其在临床研究中的应用仍然有限。在本研究中，研究人员以HeLa细胞为基准模型（n=159个细胞），通过比较新鲜细胞、低温保存细胞和多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定细胞，系统评估了适用于SCP的保存策略。两种策略均维持了可比的蛋白质组覆盖率，但固定改变了蛋白质丰度，而低温保存则基本保留了蛋白质组图谱。为评估该工作流程的转化适用性，研究人员分析了来自一位健康供体的单个外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），比较了新鲜分离的细胞（n=77）与经低温保存后进行长期储存的细胞（n=75）。在PBMCs中，低温保存并未显著影响蛋白质群鉴定数量、细胞形态、蛋白质组覆盖率或全局蛋白质组景观。综上所述，这些结果表明，在本研究所评估的条件下，低温保存为保存下游SCP所需原代免疫细胞提供了一种可行策略，而基于单个HeLa细胞的比较性保存策略则突显了固定和低温保存对未来临床应用的优势与挑战。

论文解读文章

一、研究背景与目的

基于质谱的单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics，SCP）在过去十年中迅速发展成为一项重要的分析方法。由于蛋白质比RNA更直接地反映表型，SCP有望揭示单细胞RNA测序无法阐明的细胞机制，并在细胞亚型中发现新的潜在疾病特征。然而，将SCP应用于血液等复杂异质性细胞群体仍面临巨大挑战。血液作为易于获取的生物信息来源，其循环免疫细胞虽仅占血细胞的一小部分，却在肿瘤监视、免疫调节和转移扩散中发挥关键作用。因此，将SCP应用于血源性免疫细胞，为解析免疫异质性和识别与癌症进展相关的功能性细胞状态提供了有力手段。

临床样本在SCP层面应用的主要挑战之一是需要多学科协同、同步化且训练有素的团队，以及明确的细胞采集和储存方案。此外，样本运输取决于采集区域，运输可能耗时数天，若使用干冰或液氮储存，还需在运输期间补充。尽管已有研究利用永生化细胞和体内小鼠模型评估了液氮低温保存或多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定的细胞运输方案，但这些研究未将储存条件应用于临床人类生物体液样本的短期或长期保存。PFA固定和低温保存是临床样本下游分析前广泛使用的策略，但PFA固定可能通过蛋白质交联改变蛋白质组组成，而低温保存对单细胞蛋白质组图谱的影响仍未得到充分表征。因此，建立能够保持蛋白质组完整性的保存策略对于SCP在临床样本中的可靠应用至关重要。

本研究旨在系统评估不同保存策略对SCP测量的影响，并建立一套适用于临床相关样本的工作流程。研究人员以HeLa细胞为基准模型，比较了新鲜处理、PFA固定和低温保存条件下的单细胞蛋白质组学表现，并将选定的保存策略应用于来自一位健康供体的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），以验证其临床适用性。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   单细胞分离与样品制备：使用cellenONE^? X1机器人进行单细胞分选和样品制备。所有条件（新鲜、固定、低温保存）的细胞在同一块384孔板上分选，以最小化批次效应。
2. 2.
   液相色谱-串联质谱分析：采用Vanquish Neo UHPLC系统耦合Orbitrap Astral质谱仪，结合FAIMS Pro接口进行数据非依赖性采集（data-independent acquisition，DIA）。
3. 3.
   数据处理与蛋白质鉴定：使用DIA-NN（v2.3）和Spectronaut（v19.9和v20.1）两种软件进行蛋白质鉴定，最终选择DIA-NN用于下游分析。数据库检索针对UniProt人类参考蛋白质组，并补充常见污染物和胎牛血清蛋白库。
4. 4.
   降维分析与差异丰度分析：采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和均匀流形逼近与投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）进行降维，使用Wilcoxon秩和检验和Welch t检验进行差异丰度分析，Benjamini-Hochberg校正多重检验。
5. 5.
   功能富集分析：使用g:Profiler进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析。

三、研究结果

1. Cryopreserved and fixed HeLa cells showed similar proteome coverage, but cryopreserved cells exhibited a proteomic profile more similar to fresh controls

在初始SCP实验中，研究人员培养了HeLa细胞并比较了不同条件：新鲜分离（37°C，对照）、2% PFA固定后4°C储存、-80°C低温保存，以及未经处理的4°C储存。储存时间分为1天（短期）或8天（长期）。所有样品在同一384孔板上分选以最小化技术伪影。

首先评估了不同DIA搜索工具的蛋白质鉴定性能。DIA-NN相比Spectronaut始终鉴定到更多数量和多样性的蛋白质群（protein groups，PGs），且在空白对照中鉴定更少，表明其能更好地区分样本信号与背景噪声，因此被选用于下游分析。

对照组平均鉴定到2,345个PGs和9,134个肽段，单个HeLa细胞最多鉴定到3,510个PGs。低温保存和固定条件下PGs和肽段平均数均有所下降，但两种策略结果相似。4°C储存1天的细胞蛋白质鉴定数最低，8天后59%细胞死亡，该条件被排除。

各条件的变异系数和中位漏切率保持一致，新鲜细胞变异最小。肽段长度分布和动态范围（约五个数量级）在各条件下相似。虽然低温保存导致白蛋白和酪蛋白水平升高，但总体定量谱与新鲜细胞相当。蛋白质序列覆盖率在各条件下也相似。

PCA和UMAP分析显示，PFA处理细胞与其他条件明显分离。Leiden聚类（分辨率为0.2）得到两个主要簇，分别对应固定和未固定细胞。固定细胞的标记物主要涉及腔室细胞组分和代谢分子功能。

细胞形态测量分析显示，新鲜细胞中位直径更大、伸长分布更窄，圆形度在新鲜条件下较固定条件更窄，但与低温保存条件无显著差异。研究人员进一步分析了31种细胞周期相关蛋白，发现新鲜细胞和多种保存条件下，估计细胞体积与细胞周期蛋白评分呈正相关，主要由G2/M期和有丝分裂调控相关蛋白驱动。

最后，固定细胞中686个PGs丰度降低（主要涉及代谢过程），35个PGs丰度增加（涉及胆固醇合成等生物合成途径）。PFA孵育30分钟的细胞变化少于15分钟，提示部分保护效应。低温保存条件下未观察到显著差异，而4°C储存1天的细胞出现与细胞焦亡相关的蛋白上调。

2. Cryopreservation was compatible with SCP in PBMCs

为验证工作流程对原代人免疫细胞的适用性，研究人员评估了低温保存对来自一位健康供体PBMCs的影响。

新鲜分离PBMCs平均鉴定到750个PGs，低温保存8天后平均鉴定到970个PGs，单个低温保存细胞最多量化到1,499个PGs。两组CV无显著差异，但PBMCs的CV高于HeLa细胞，可能归因于混合细胞群体和体外/离体条件差异。PG计数与细胞直径呈正相关。新鲜和低温保存PBMCs的细胞直径、伸长和圆形度无显著差异，活力均约为97%。低温保存细胞平均直径略有增加，可能贡献了更高的PG鉴定数。

为降低背景污染，空白对照中鉴定到的PGs以及PGs数低于150的细胞被排除。PCA和UMAP投影显示新鲜和低温保存PBMCs聚集在一起。差异分析中，低温保存条件下无蛋白丰度降低，仅一种蛋白（核糖体生物发生因子URB1）丰度升高。

无监督Leiden聚类（分辨率为1）识别出六个蛋白质组簇。基于经典标志物蛋白和人类基因图谱的细胞类型注释揭示了主要的循环免疫细胞群体，包括CD14⁺单核细胞（簇0）、CD56⁺ NK/T细胞（簇1）和CD19⁺ B细胞（簇5）。重要的是，新鲜和低温保存样本的细胞分布于所有鉴定的免疫细胞群体中，表明低温保存保留了识别主要免疫细胞群体所需的蛋白质组特征。两种条件下淋巴细胞比例（61-63%）均高于单核细胞（36-38%）。

四、讨论与结论

讨论指出，SCP方法在血液等临床样本中的应用目前不仅受限于质谱性能，还受制于尚未充分研究的分析前变量。与单细胞RNA测序不同，蛋白质无法扩增，因此样品采集、保存、运输或储存过程中引入的蛋白质降解、泄漏或提取效率低下是不可逆的，直接影响蛋白质组的深度和质量。

本研究系统评估了PFA固定和低温保存两种策略对SCP的影响。在HeLa细胞模型中，两种策略均保持了相当的蛋白质组覆盖率和变异性，但PFA固定导致显著的蛋白质组变化，而低温保存基本保持了与新鲜细胞高度相似的蛋白质组图谱。在PBMCs中，低温保存未显著影响蛋白质组鉴定、细胞形态、蛋白质组覆盖率和全局蛋白质组景观，且不损害细胞类型分辨能力或定量蛋白质组分析。

研究结论：在本研究所测试的条件下，低温保存为保存原代免疫细胞用于下游SCP提供了一种可行策略，能够在不影响细胞类型分辨率或定量蛋白质组分析的前提下，保持PBMCs的单细胞蛋白质组图谱。这些发现支持低温保存用于健康供体和疾病供体SCP兼容性样本储存的可行性，同时认识到不同医院和实验室的具体条件、工作流程和可用资源可能需要调整样本采集和保存策略。