丙酸血症患者诱导多能干细胞来源星形胶质细胞呈现稳态功能受损与反应性样特征

《The Journal of Pathology》：Patient iPSC-derived astrocytes reveal impaired homeostasis and reactive-like features in propionic acidemia

　　

丙酸血症（propionic acidemia, PA）是一种由丙酰辅酶A羧化酶（propionyl-CoA carboxylase, PCC）缺乏引起的神经代谢性疾病，常伴有神经系统受累，但细胞类型特异性的机制仍不清楚。研究人员从携带PCCA或PCCB基因突变的患者中建立了人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的星形胶质细胞（iPSC-derived astrocytes, iAs），并研究了与PA相关的功能和分子改变。对照来源和患者来源的iPSC均通过神经祖细胞中间阶段产生了星形胶质细胞富集培养物，并表达星形胶质细胞相关标志物。患者iAs表现出线粒体呼吸功能受损（基础耗氧量、最大耗氧量和ATP偶联呼吸均降低），同时谷氨酸和甘氨酸神经递质的高亲和力摄取减少，并存在Ca2+稳态紊乱的证据。此外，患者iAs在伤口愈合实验中迁移更快，并表现出反应性样特征，包括胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和连接蛋白43（connexin 43, Cx43）蛋白水平升高，以及AQP4 mRNA水平上调。靶向miRNA分析显示，miR-124-3p、miR-9-5p和miR-125b-5p上调，同时miR-146a-5p、miR-155-5p和miR-145-5p下调。与这些变化一致，与固有免疫信号（IRAK1、TRAF6、TAB2）、星形胶质细胞重塑（GFAP）和水/离子稳态（AQP4）相关的已报道靶基因均上调。炎症和增殖标志物同样增加，包括IL1B、TNF和MKI67。总之，这些汇聚性改变提示一种以稳态功能受损和反应性样特征为特征的表型，这可能加剧代谢应激下神经网络的脆弱性。综上，研究数据支持星形胶质细胞功能障碍可能是PA神经病理学的潜在贡献因素，并凸显患者来源的iAs可作为未来机制研究和治疗探索的有用模型。? 2026 The Author(s). The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of The Pathological Society of Great Britain and Ireland.

论文解读

一、研究背景与科学问题

星形胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中数量最丰富的胶质细胞类型，在突触形成、突触可塑性调节、神经元代谢支持、神经递质回收、离子稳态维持、血脑屏障完整性保护以及白质髓鞘化促进等方面发挥多种重要功能。此外，星形胶质细胞具有一种进化上保守的防御机制——反应性胶质增生（reactive gliosis），由CNS损伤触发，涉及细胞肥大和中间丝蛋白表达增加等多种疾病特异性细胞反应。星形胶质细胞功能障碍已被证实与肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）、阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等多种神经退行性疾病相关，也与遗传性代谢疾病有关。

丙酸血症（propionic acidemia, PA；OMIM #606054）是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由PCCA或PCCB基因突变引起，导致生物素依赖性线粒体酶丙酰辅酶A羧化酶（propionyl-CoA carboxylase, PCC）缺乏。PCC功能障碍导致丙酰辅酶A及其他代谢物（如3-羟基丙酸、2-甲基柠檬酸、丙酰肉碱和丙酸）蓄积，引发严重代谢失衡和多系统损害，包括对脑的显著影响。PA的神经系统表现包括癫痫发作、基底节异常、锥体外系症状、脑皮质萎缩和代谢性卒中，常导致肌张力减退、嗜睡、发育和生长迟缓、癫痫、精神运动发育迟滞和/或智力障碍。尽管潜在的神经毒性机制尚未完全阐明，但已提出多种因素：丙酰辅酶A蓄积抑制N-乙酰谷氨酸合酶，损害尿素循环并导致高氨血症，进而可能通过细胞外谷氨酸水平升高引起N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体过度激活；丙酸还抑制γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）转氨酶，增加细胞外GABA水平。星形胶质细胞在这些病理生理过程中处于核心地位：它们通过谷氨酰胺合成酶解毒氨、代谢丙酸，并参与胶质增生和神经炎症。然而，PA中星形胶质细胞功能障碍的细胞类型特异性机制此前尚不明确。

动物模型（如低表达Pcca^?/?（A138T）小鼠）虽能复制PA的生化和临床特征，但物种间差异（尤其是脑发育和代谢方面）限制了从小鼠向人类的推断。人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）技术可克服这些限制，通过生成患者特异性的神经细胞类型（包括星形胶质细胞）在人类背景下进行疾病建模。本研究团队此前已从携带PCCA或PCCB基因突变的PA患者成纤维细胞中生成两条iPSC系。本研究将这些iPSC系分化为星形胶质细胞（iPSC-derived astrocytes, iAs），建立基于人类细胞的模型，以探索星形胶质细胞功能障碍对PA神经系统表型的贡献。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员将对照和PA患者来源的iPSC分化为神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs），再进一步分化为星形胶质细胞富集培养物，并系统评估了患者来源iAs的功能和分子改变。主要关键的技术方法包括：

1. 1.
   iPSC分化体系：使用STEMdiff神经诱导系统（双SMAD抑制单层培养法）将iPSC分化为NPCs，再使用STEMdiff星形胶质细胞分化与成熟试剂盒获得iAs。所用细胞系包括：PCCA缺陷iPSC系（PCCA23-FiPS4F6或UAMi001-A，携带c.1899+4_1899+7delAGTA和c.1430-?_1643+?del突变）、PCCB缺陷iPSC系（PCCB10-FiPS4F-1或UAMi004-A，携带c.1218_1231del14ins12纯合突变），以及来自西班牙卡洛斯三世健康研究所国家细胞系库的健康对照iPSC系（FIPS Ctrl2-SV4F-1）。
2. 2.
   分子与蛋白分析：通过RT-qPCR检测mRNA和miRNA表达，通过免疫印迹（western blotting）检测蛋白水平，通过免疫荧光染色结合共聚焦显微镜进行细胞标志物定量分析。
3. 3.
   超微结构分析：采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察细胞超微结构并定量糖原样颗粒密度。
4. 4.
   功能学检测：使用Seahorse XFe96分析仪进行线粒体应激测试评估耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）；采用³[H]-谷氨酸和³[H]-甘氨酸放射性标记摄取实验评估神经递质转运功能；使用Fluo-4-AM钙离子荧光探针进行钙成像分析；通过伤口愈合实验评估细胞迁移能力。
5. 5.
   代谢物检测：采用串联质谱法检测培养上清中丙酰肉碱水平。

三、研究结果

1. 神经祖细胞可高效地从对照和PA患者来源iPSC中分化获得

通过双SMAD抑制单层培养18–21天后，NPC身份通过PAX6和NESTIN免疫荧光染色验证，定量确认各细胞系均成功分化为神经祖细胞（约90% PAX6阳性细胞，70–90% NESTIN阳性细胞）。RT-qPCR分析显示SOX1、OTX2、NES和PAX6的表达，进一步支持NPC分化成功。

2. 从对照和PA患者来源NPC生成了星形胶质细胞富集培养物

NPCs经星形胶质细胞分化培养基处理18–20天、成熟培养基处理额外20天后，iAs培养物呈现典型星形胶质细胞样形态。免疫荧光、免疫印迹和RT-qPCR分析证实了GFAP、S100β、GLAST/EAAT1、Cx43和GLT1/EAAT2等星形胶质细胞标志物的表达。定量分析确认星形胶质细胞富集培养物中S100β和GLAST/EAAT1阳性细胞比例高（约80%–100%）。免疫印迹显示PA来源iAs中GFAP和Cx43蛋白水平升高。TEM分析显示所有细胞系均具有星形胶质细胞样超微结构特征（含丝状束的细胞质突起），PA来源星形胶质细胞（尤其是PCCB系）糖原样颗粒密度增加。免疫印迹证实PA来源iAs中相应PCC亚基缺失，丙酰肉碱水平在PCCA iAs中升高3倍（0.15 μM）、PCCB iAs中升高6倍（0.29 μM），与对照（0.05 μM）相比显著增加。

3. 患者来源星形胶质细胞线粒体呼吸受损且神经递质摄取减少

Seahorse线粒体应激测试显示，PCCA和PCCB iAs的基础呼吸、ATP产生和最大呼吸能力均较对照iAs降低，提示线粒体呼吸功能受损。免疫印迹显示PA iAs中抗氧化蛋白GPx1表达降低，提示抗氧化防御能力受损。放射性标记摄取实验显示，患者来源iAs对谷氨酸和甘氨酸的钠依赖性摄取均减少，其中PCCB iAs的降低具有统计学显著性，PCCA细胞呈现类似趋势但未达显著水平。

4. PA iAs中Ca²⁺信号受损且损伤诱导的迁移增强

静息条件下，PCCB iAs中自发活跃细胞百分比降低，PA来源星形胶质细胞每个细胞的Ca²⁺尖峰数少于对照，PCCA iAs中尖峰幅度降低。在无Ca²⁺培养基中ATP刺激后，各细胞系均产生Ca²⁺瞬变，但反应幅度无显著差异。伤口愈合实验显示，PCCA和PCCB iAs的伤口闭合速度均快于对照细胞，提示迁移能力增强。

5. 患者来源星形胶质细胞中miRNA表达改变

RT-qPCR分析显示，miR-125b-5p在两种PA细胞系中均显著上调，miR-124-3p和miR-9-5p在PCCB iAs中升高更显著；相反，miR-146a-5p、miR-155-5p和miR-145-5p在PA来源细胞系中显著下调。与这些miRNA变化一致，其靶基因表达发生相应改变：miR-145-5p的靶基因GFAP和AQP4上调（尤其在PCCB iAs中），miR-146a-5p的靶基因IRAK1和TRAF6以及miR-155-5p的靶基因TAB2均不同程度增加，支持炎症信号通路的参与。

6. PA iAs中炎症和增殖相关标志物上调

RT-qPCR显示，IL1B在PCCA和PCCB iAs中均显著上调；TNF在两种PA细胞系中呈上升趋势，仅在PCCB iAs中达到统计学显著性；MKI67（细胞增殖标志物）mRNA水平显著升高，尤其在PCCB iAs中。

四、讨论与结论

研究结果表明，PA患者来源的人iPSC星形胶质细胞表现出线粒体呼吸受损、神经递质摄取减少、基础Ca²⁺信号改变、损伤诱导迁移增强，以及符合反应性样星形胶质细胞重塑和炎症信号的miRNA谱。这些汇聚性改变支持星形胶质细胞功能障碍在PA神经病理学中的作用。PCCA和PCCB缺陷细胞系之间的相似性提示，下游星形胶质细胞改变可能至少部分源于PCC缺乏相关的共享代谢应激因素，而非完全基因特异性过程；但PCCB iAs中更显著的变化可能反映更严重的疾病相关表型，与其更高的丙酰肉碱水平一致。

在分子层面，miR-155-5p和miR-146a-5p水平降低伴随TAB2、IRAK1和TRAF6 mRNA表达升高，提示Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）/核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）相关信号通路的参与；miR-145-5p降低以及miR-9-5p、miR-125b-5p和miR-124-3p上调支持促迁移和反应性星形胶质细胞表型。能量需求高的星形胶质细胞功能（尤其是高亲和力谷氨酸清除）依赖于充足的线粒体输出和膜极化，观察到的呼吸功能降低与GPx1表达减少恰好与谷氨酸和甘氨酸摄取降低相吻合，提示生物能量限制可能损害转运体循环和/或表面运输，从而损害突触稳态并增加PA中兴奋性毒性应激的易感性。PA相关代谢物可通过克雷布斯循环和呼吸链抑制、谷氨酸氧化受损、线粒体通透性转换和辅酶A螯合/耗竭等机制损害线粒体生物能量和Ca²⁺稳态。糖原样颗粒密度增加进一步支持PA来源iAs中代谢稳态改变。基础Ca²⁺动力学改变可能影响Ca²⁺依赖的胶质递质释放和神经元-胶质细胞通讯。增强的迁移能力与反应性星形胶质细胞中Cx43半通道开放和细胞内Ca²⁺升高的已知作用一致。

本研究的局限性包括：样本量较小、缺乏同基因CRISPR校正对照、星形胶质细胞单培养无法捕捉神经元-星形胶质细胞串扰、部分读数主要在转录水平评估、miRNA表达与转录本丰度变化之间的关系仍属相关性而非直接因果性。

研究结论：研究结果提示星形胶质细胞功能障碍可能参与PA的神经系统表现，并凸显星形胶质细胞作为未来机制研究和治疗探索的重要靶点。