基因组数据揭示摩洛哥西南部蜥蜴Acanthodactylus erythrurus谱系地理断裂的维持机制：内在生殖隔离而非当代迁移屏障的主导作用

《Molecular Ecology》：Phylogeographic Breaks With and Without Contemporary Barriers to Migration in the Lizard Acanthodactylus erythrurus

　　

摘要 识别谱系地理断裂（phylogeographic breaks），并厘清环境外在因素（如地质屏障、生态梯度）与生物内在因素（如有限扩散、生殖不兼容）对其持续存在的相对贡献，仍然是一项挑战，尤其是在缺乏基因组数据的情况下。本研究利用摩洛哥西南部侧纹蜥（Acanthodactylus erythrurus）的同域分布谱系（parapatric lineages）来探讨这一问题。先前基于九个核基因座的研究识别出两个谱系地理单元（沿海与内陆），其分离与阻止迁移的景观特征并不吻合。沿海谱系被推断在隔离距离（IBD，即遗传分化随地理距离的规律性增加）模式下演化，尽管其分布范围内存在大型河流。这表明要么谱系地理断裂与景观特征不吻合，要么有限的标记集合阻碍了对谱系地理断裂的准确推断。研究人员利用RADseq数据检验了这些假说，恢复了三个谱系，每个谱系均由谱系地理断裂和狭窄的接触带（contact zones）分隔，且基因渗入（admixture）有限。先前被鉴定为在IBD模式下演化的沿海种群实际上包含两个谱系，它们被一条大型常流河分隔，从而减少了迁移。内陆谱系地理断裂（先前研究已正确识别）位于连续分布的栖息地中。两个断裂均未与生物气候变量的急剧变化吻合，表明局部适应（local adaptation）的贡献可忽略不计。研究人员得出结论：内在生殖屏障（由基因组上多个基因座的等位基因频率狭窄渐变群（narrow clines）所证明）在维持这些谱系地理断裂中发挥主要作用。研究结果还凸显了从基因组时代之前的分子数据中识别谱系地理断裂的困难。

论文解读

一、研究背景与问题

谱系地理断裂（phylogeographic breaks）是指遗传多样性在地理分布上的不连续性，是系统发育地理学中重要的研究模式，能够为种群的历史与当代隔离提供宝贵信息。这类断裂通常在种群被地理屏障（geographical barriers）隔离后，通过异域分化（allopatric divergence）过程中遗传差异的积累而形成。然而，并非所有隔离事件都会导致物种形成：如果异域隔离时间过短，不足以演化出生殖屏障，谱系在次生接触（secondary contact）时可能重新融合。因此，理解谱系地理断裂的维持机制，需要仔细区分谱系之间是存在生殖隔离、被地理迁移屏障分隔，还是仅仅代表过去隔离事件的遗迹而正在逐渐同质化。

在许多情况下，谱系地理断裂与当代迁移屏障（如河流、山脉）相吻合。但迁移屏障可能随时间消失，使遗传分化的谱系发生次生接触，此时遗传分化的持续存在将依赖于内在生殖屏障、生态分化以及小尺度空间隔离等因素。由于内在生殖屏障在异域隔离中的建立是一个漫长过程，隔离时间可能是无外在屏障条件下谱系地理断裂的主要驱动因素。相比之下，局部适应（local adaptation）可能在较小时时间尺度上对谱系地理结构产生不成比例的贡献，因为对分化环境的适应可导致外在生殖隔离的快速演化。然而，这些因素在物种内和地理区域间的相互作用尚不十分清楚。

另一个困难在于，谱系地理断裂的准确检测并非易事。在连续种群中（例如在隔离距离（IBD）模式下演化的种群），尤其是存在较大采样空白时，可能检测到虚假的不连续性信号。反之，当所用分子标记信息量不足时，谱系地理断裂可能被低估。线粒体DNA（mtDNA）长期是研究遗传多样性地理格局的首选标记，但mtDNA中的谱系地理断裂不一定与核标记中的断裂一致。测序技术的发展使得即使在非模式生物中也能收集数千个核标记，基于全基因组基因型并通过空间显式统计框架分析谱系地理格局，对于理解谱系地理断裂维持因素至关重要。

本研究关注的侧纹蜥（Acanthodactylus erythrurus）物种复合体广泛分布于伊比利亚半岛和马格里布地区。近期基于mtDNA和多基因座核标记的研究揭示了高度的遗传多样性和复杂的谱系地理结构，摩洛哥境内至少有11个线粒体谱系，初始分化时间估计约在10百万年前。然而，基于九个核标记的研究恢复的遗传结构弱得多，该研究认为摩洛哥所有种群可分为至少四个隔离谱系，谱系内种群被认为在IBD模式下演化，提示mtDNA大大高估了谱系地理断裂的数量。但基于基因组数据对摩洛哥东北部部分种群的分析表明，增加标记数量可改善谱系地理断裂的识别，一些用九个核标记无法排除IBD的种群实际上代表两个隔离的物种级谱系。摩洛哥大西洋沿岸的情况更为令人困惑：该区域存在六个mtDNA谱系，但核数据仅检测到一个谱系地理断裂（位于北部拉腊什附近）。这一结果令人惊讶，因为沿岸存在多条大型河流可能构成强迁移屏障。研究人员提出三个非排他性假说：（1）所用标记分辨率不足导致大西洋沿岸谱系地理断裂数量被低估；（2）河流对A. erythrurus的扩散并非有效屏障；（3）当代扩散屏障与谱系地理断裂不相关。

二、研究内容与结论

为检验上述假说，研究人员使用限制性位点关联DNA测序（RADseq）技术，从摩洛哥西南部沿海和内陆A. erythrurus种群中生成数千个全基因组单核苷酸多态性（SNP），并沿两条新断面大幅丰富了采样，连接三个先前已识别的线粒体谱系，重建了这些种群的谱系地理历史。研究目的包括：（1）验证基于少数标记的先前研究结论（即内陆Mara与沿海S-Atl之间存在谱系地理断裂但大西洋沿岸无断裂）在基因组数据下是否仍然成立；（2）评估接触带谱系间的生殖隔离水平，以了解物种形成在维持这些谱系中的作用；（3）评估谱系地理断裂是否与当代地理特征和生态转变相关。

研究得出以下主要结论：基因组数据恢复了三个分化良好的谱系（Mara、S-Atl和S-Bou），每个谱系由谱系地理断裂和狭窄接触带分隔，基因渗入有限。先前被认为在IBD模式下演化的沿海种群实际上包含两个谱系，被乌姆赖比阿河（Oum Er R'bia）这条大型常流河分隔。内陆Mara与S-Atl之间的谱系地理断裂位于连续分布的栖息地中，无阻止迁移的景观特征。两个断裂均未与生物气候变量的急剧变化吻合，表明局部适应贡献可忽略。地理渐变群分析（geographic cline analyses）显示极窄的渐变群宽度和几乎完全缺乏基因渗入，表明内在生殖屏障在维持这些谱系地理断裂中发挥主要作用。系统发育重建估计Mara与S-Atl的分化时间约为4.36百万年前，S-Bou与S-Yah的分化时间约为3.72百万年前。研究还表明，基于少数标记的谱系地理研究可能产生误导性结果，基因组数据能显著提高识别独立演化谱系的能力。

三、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）RADseq测序：采用限制性位点相关DNA测序协议，使用SbfI酶消化基因组DNA，构建简化基因组文库，在NovaSeq 6000平台上进行双端100 bp测序，生成全基因组SNP数据；（2）种群结构分析：利用主成分分析（PCA）和贝叶斯聚类算法STRUCTURE推断种群结构和个体祖先成分；（3）谱系地理断裂检验：采用基于遗传距离与地理距离线性回归的统计检验方法（Hausdorf和Hennig的方法），比较组内与组间回归是否显著不同；（4）地理渐变群分析：使用Hzar软件对STRUCTURE Q值和诊断性SNP等位基因频率拟合S形渐变群，估计渐变群宽度和中心位置；（5）环境变量分析：从WorldClim数据集提取19个生物气候变量，使用主成分分析（PCA）总结环境变异，检验接触带是否与陡峭生态梯度吻合；（6）系统发育重建与分化时间估计：使用IQTREE进行最大似然（ML）系统发育推断，采用最小二乘定年法（LSD）进行时间校准，以伊比利亚与里夫谱系的分化（5.4百万年前，墨西拿盐度危机结束）作为校准点。样本包括131个A. erythrurus个体（2004–2019年采集），覆盖Mara、S-Atl和S-Bou谱系的已知分布范围及新增采样点，另有46个来自突尼斯、阿尔及利亚、摩洛哥和西班牙的Acantodactylus样本用于系统发育推断。

四、研究结果

1. 1.
   RADseq数据组装

测序共获得1,719,963,194个原始读段对，经质量过滤和PCR重复去除后保留613,491,320个。组装1（仅含Mara、S-Atl和S-Bou谱系）产生19,209–36,561个基因座（19,188–36,561个非连锁SNP），平均覆盖深度32.05×。组装2（含整个A. erythrurus复合体代表）包含17,374–51,088个RAD基因座，取决于允许的缺失数据水平。

1. 2.
   种群结构

基于19,188个非连锁SNP的PCA清晰划分出三个不同聚类：Mara（内陆，距大西洋海岸28公里起）、S-Atl（约15公里宽的沿海地带，北至乌姆赖比阿河）和S-Bou（乌姆赖比阿河以北至卡萨布兰卡的所有沿海地点）。STRUCTURE分析支持最优聚类解为三组，与PCA聚类完全一致，大多数样本的分配概率Q>0.98，基因渗入信号非常微弱。唯一检测到少量渗入的S-Atl种群是沿断面最接近Mara的种群（Q≈0.08）。

1. 3.
   隔离距离检验

三个谱系内部均发现遗传距离与地理距离正相关（S-Bou: R2=0.34，斜率0.10；S-Atl: R2=0.13，斜率0.03；Mara: R2=0.34，斜率0.19）。组内回归在统计上相似，允许合并比较。S-Atl与S-Bou之间（p=0.038）以及S-Atl与Mara之间（p=1.24e??）的组间回归均与组内回归显著不同，证实相邻谱系间存在谱系地理断裂。

1. 4.
   地理渐变群分析

S-Atl—Mara断面的Q值由简单S形渐变群最佳拟合（无渗入尾部），估计宽度0.61公里（CI=0–39.72公里），中心位于距大西洋海岸36.38公里处，落在采样空白中间。734个诊断性SNP的等位基因频率也由简单渐变群最佳拟合，平均宽度3.84公里，平均中心35.45公里。S-Bou—S-Atl断面的Q值同样由简单渐变群拟合，宽度0.11公里，中心位于乌姆赖比阿河河口（距断面起点59.26公里）。220个诊断性SNP的平均宽度7.81公里，平均中心66.78公里，但排除异常值后（189个SNP，85.91%），平均宽度降至0.64公里，平均中心59.06公里。

1. 5.
   环境变量变化与隔离环境

两条断面上的19个生物气候变量PCA第一轴解释了大部分气候变异（Mara—S-Atl：88.30%；S-Bou—S-Atl：63.71%），反映纬度/经度方向的线性气候梯度。S-Atl—Mara断面的PC2和PC3在渐变群中心附近出现拐点，但未清晰分离S-Atl和Mara地点，组间气候差异不高于组内。S-Bou—S-Atl断面的PC3在渐变群中心附近有拐点，但组间气候差异同样不显著。距离矩阵多元回归未发现环境对遗传分化的显著贡献。

1. 6.
   系统发育重建与分化时间估计

四种缺失数据阈值（60%、40%、20%、10%）下的系统发育推断产生单一高度支持拓扑，所有内部节点支持率>97%。拓扑将A. erythrurus复合体分为两个主要谱系：伊比利亚-摩洛哥支系（含S-Bou、S-Yah、S-Atl、Mara、Mid-Atl、M-Bou、N-Atl、Rif和Iberia）和阿尔及利亚-突尼斯支系（含Algero-Tunisia、Central Algeria和A. blanci）。两主支系分化于12.02百万年前（CI=10.17–13.95），伊比利亚-摩洛哥支系冠群估计为6.93百万年前（CI=6.50–7.64）。研究焦点谱系Mara、S-Atl和S-Bou所在的支系起源于4.53百万年前（CI=4.00–5.07），Mara与S-Atl为姐妹谱系（分化时间4.36百万年前，CI=3.85–5.01），S-Bou与S-Yah为姐妹谱系（分化时间3.72百万年前，CI=3.25–4.23）。

五、讨论与结论

研究发现，景观级迁移屏障并非维持谱系地理断裂所必需。S-Atl与S-Bou之间的渐变群中心与乌姆赖比阿河河口吻合，河流可能通过减少迁移而促成谱系地理格局。但S-Atl分布范围内还有两条常流河（滕西夫特河和克苏布河）穿过，却未对种群结构产生可感知的影响，表明并非所有河流都构成有效屏障。S-Atl与Mara之间的转变则完全不与阻止迁移的景观特征吻合，断面穿越连续的中旱生栖息地。环境分析未发现生物气候变量在渐变群中心出现急剧转变，组间气候差异不高于组内，排除了局部适应在维持该断裂中的主要作用。

狭窄的地理渐变群表明谱系间存在内在生殖隔离。两个断面的祖先渐变群宽度仅为0.6–4公里，数百个非连锁诊断性SNP支持与祖先渐变群一致的渐变群，缺乏渗入尾部，这是张力带（tension zones）的典型模式，即杂种受到反选择。考虑到谱系内结构较弱且IBD斜率较弱（表明扩散能力不低），狭窄渐变群更可能反映强烈的杂种选择而非有限扩散。分化时间4.3–4.5百万年足以演化出近乎完全的生殖隔离。大量基因座支持狭窄渐变群表明生殖隔离具有高度多基因基础，但S-Atl与Mara在Z染色体形态上的显著差异可能对杂种功能障碍有重要贡献。

在系统学意义上，S-Atl、S-Bou和Mara之间的高遗传分化水平和缺乏基因渗入强烈表明这些谱系代表独立的物种。研究结果进一步证实A. erythrurus复合体是一个包含许多隐存物种的大陆辐射。系统发育分析显示伊比利亚-摩洛哥支系内大多数线粒体谱系都得到基因组数据的良好支持，可能代表隔离谱系，与先前基于少数核标记的结论相反。

研究结论：基因组数据揭示了摩洛哥西南部一个受限地理区域内存在三个演化谱系，具有内在生殖隔离的证据。这些发现支持物种形成而非纯粹外在地理隔离在构建这些生物多样性中发挥的作用。研究结果还表明，基因流的地理屏障和陡峭生态梯度并非维持谱系地理断裂所必需。研究人员提出一个模型：祖先分布区破碎导致异域分化，高生态位保守性阻止次生同域分布的确立。内在生殖隔离在维持谱系分化中发挥重要作用，表明隔离时间是解释谱系地理断裂存在和陡峭程度的关键因素。初始破碎的原因仍是一个开放问题，乌姆赖比阿河在4–5百万年前改道至当前河道可能启动了S-Bou的分化，上新世以来的干湿周期循环可能通过将种群隔离在较湿润的避难所中而促进隔离。A. erythrurus辐射是理解北非生物多样性构建中外在和内在因素的有前景的研究系统。