细菌靛蓝素（Indigoidine）作为天然色素的可持续高产：稳定性评估、对肥胖-糖尿病相关消化酶的抑制及AMPK–AKT通路的激活

《MicrobiologyOpen》：Sustainable Overproduction of the Bacterial Pigment Indigoidine as a Natural Colorant: Stability Evaluation, Inhibition of Obesity-Diabetes-Related Digestive Enzymes, and Activation of AMPK–AKT

　　

摘要专业翻译 对细菌色素的关注日益增加，可归因于其相较于可能导致严重健康问题的人工食品着色剂具有更高的安全性和生态友好性。本研究旨在优化不同生长条件下的靛蓝素（IND）产量，评估其化学稳定性，并研究其与糖尿病、肥胖和胰岛素抵抗相关的潜在生物活性。培养基类型对BL21-DE3细胞生长和IND产量均起重要作用。BL21-DE3细胞在PGB培养基中生长量最大（2.76 g/L/24 h），其次为LB-O培养基（1.29 g/L/24 h）、LB培养基（1.14 g/L/24 h）和NB培养基（0.94 g/L/24 h）。IND在LB、NB和PGB培养基中的产量分别为75.8、49.8和38.9 mg/L/24 h，而实验获得的最高IND产量是在LB-O培养基中达到的（177.4 mg/L/24 h），这与理论IND产量180 mg/L/24 h非常接近。IND表现出高细胞吸收特性、低细胞毒性以及对α-淀粉酶和脂肪酶呈剂量依赖性抑制，IC50值分别为0.69和0.37 μg/mL。此外，IND增强了5'-腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）和蛋白激酶B（AKT）信号通路，EC50值分别为1.36和4.59 μg/mL。通过分子对接还观察到IND与α-淀粉酶、脂肪酶、AMPK和AKT酶的结合亲和力，结合能（BE）分别为?7.4、?8.1、?6.9和?5.5 kcal/mol。所有这些发现均通过人类精子细胞培养得到证实，其中IND刺激了葡萄糖代谢以及AMPK和AKT信号通路。

论文解读文章

研究背景与目的

合成着色剂因其低成本和高稳定性被广泛用于食品、药品和化妆品，但大量研究表明，诸如诱惑红、柠檬黄、日落黄和胭脂红等常用染料可能诱导消费者产生多种毒性效应，包括不同器官的氧化损伤、系统性炎症、免疫系统抑制、男性生育能力下降及其他生理紊乱。此外，这些着色剂还可能引起过敏反应，尤其影响儿童的皮肤、呼吸系统和消化道。从环境角度看，合成染料的高稳定性和难生物降解性使其在水体、土壤、植物和动物中持久存在并累积，导致生态系统破坏，而其环境转化可能产生有毒甚至致癌的副产物。为避免这些危害，开发天然、生态友好、可持续的替代品至关重要。细菌色素正是此类选择之一，其中由多种细菌产生的天然蓝色素——靛蓝素（IND）因其令人兴奋的药理效应而被广泛研究，如抗氧化、抗菌和抗炎活性。然而，如何提高IND的生产效率并探索其在代谢疾病方面的潜力仍是重要课题。因此，本研究旨在通过优化发酵条件提高IND产量，评估其稳定性与毒性，并首次探究其对肥胖相关脂肪酶、糖尿病相关α-淀粉酶以及胰岛素抵抗相关AMPK和AKT通路的影响。

研究方法概述

研究人员首先筛选了最有利于IND生产的培养基，随后采用Plackett–Burman设计识别关键影响因素，并通过中心复合设计（CCD）结合响应面法（RSM）进行最终优化。IND通过超声破碎和离心提取，纯度经高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）和紫外-可见分光光度法验证。稳定性评估涵盖不同pH、温度、储存时间和光照条件。生物活性方面，通过体外酶活测定评估IND对α-淀粉酶和脂肪酶的抑制作用，以及对AMPK和AKT的激活作用，并结合AutoDock 4.2进行分子对接分析。细胞实验使用来自健康志愿者的红细胞和人精子细胞，分别评估毒性和葡萄糖代谢促进效果。

研究结果

3.1 培养基对IND产量的影响

标准LB培养基的IND产量为75.8 mg/L/24 h，高于NB（49.8 mg/L/24 h）和PGB（38.9 mg/L/24 h），尽管PGB支持最高的细菌生物量增长（2.76 g/L/24 h）。

3.2 利用CCD进行IND产量最终优化

通过响应面和等高线图分析，确定最优参数为葡萄糖1.02%、胰蛋白胨1.52%和酵母提取物0.81%，模型预测最大产量约180 mg/L/24 h，实验验证值为177.4 mg/L/24 h。

3.3 标准与优化LB培养基对比

优化后的LB-OP培养基（含1.52%胰蛋白胨、0.81%酵母提取物、1.09%葡萄糖、0.875% NaCl、0.050% MgSO₄·7H₂O、0.100% KH₂PO₄、1.13% L-谷氨酰胺，pH 7.8，29°C，200 rpm）使IND产量从75.8提升至177.4 mg/L/24 h，提高了2.34倍，同时生物量略有增加。

3.4 IND的纯化与鉴定

HPLC-DAD和LC-MS分析显示IND纯度达92.3%，紫外-可见光谱在612 nm处呈现特征吸收峰。

3.5 IND的稳定性评估

IND在中性pH（7.8）下最稳定（半衰期150 h），极端酸性（pH 1）和碱性（pH 12）下迅速降解（半衰期分别为3 h和10 h）。低温（4°C）显著增强稳定性（半衰期240 h），高温（100°C）则快速降解（半衰期2 h）。避光条件下稳定性最佳（半衰期220 h），紫外线下极不稳定（半衰期20 h）。储存时间延长会降低稳定性。

3.6 IND对人红细胞的毒性

在0.5–50 μg/mL浓度范围内，IND表现出极低的细胞毒性。0.5–10 μg/mL时溶血率低于2%，即使在高浓度50 μg/mL时也仅为5.29%，处于公认的无毒阈值内。

3.7 IND的膜生物利用度

IND呈浓度依赖性地分布于细胞内和细胞外。低浓度（0.5–1 μg/mL）时主要位于细胞内（>87%），随浓度升高，细胞内比例逐渐下降，高浓度（30–50 μg/mL）时主要存在于细胞外（约78%–80%）。

3.8 IND对α-淀粉酶活性的影响

IND呈剂量依赖性地抑制α-淀粉酶活性，IC₅₀为0.69 μg/mL（阳性对照阿卡波糖为0.36 μg/mL）。分子对接显示结合能为?7.4 kcal/mol，与阿卡波糖（?7.7 kcal/mol）相近，并与ASP197、ASP300、GLN63形成氢键，与TRP59形成π-π相互作用。

3.9 IND对脂肪酶活性的影响

IND同样呈剂量依赖性地抑制胰腺脂肪酶，IC₅₀为0.37 μg/mL，优于阳性对照奥利司他（0.62 μg/mL）。分子对接结合能为?8.1 kcal/mol，高于奥利司他（?6.9 kcal/mol），与ASP79、ARG256、GLY76等残基形成稳定互作。

3.10 IND对AMPK活性的影响

IND呈剂量依赖性地激活AMPK，在2.8 μg/mL时达到最大激活（65.1%），EC₅₀为1.36 μg/mL（阳性对照A-769662为0.98 μg/mL）。分子对接结合能为?6.9 kcal/mol，与ARG B107、LEU A18、SER B103等残基形成多种相互作用。

3.11 IND对AKT活性的影响

IND呈剂量依赖性地激活AKT，在6 μg/mL时达到最大激活（65.6%），EC₅₀为4.59 μg/mL（阳性对照SC79约为3.2 μg/mL）。分子对接结合能为?5.5 kcal/mol，与SC79（?5.6 kcal/mol）非常接近，与ARG23、GLU17、ARG15等残基形成氢键。

3.12 IND对人精子细胞葡萄糖消耗的影响

IND在20 μg/mL时使葡萄糖消耗增至133.4%，优于或等同于A-769662和SC79，且在更高浓度下表现出更低的毒性，表明其具有良好的代谢稳定性和安全性。

3.13 IND对人精子细胞AMPK活性的影响

IND在15 μg/mL时使AMPK活性升至128.9%，高于A-769662在相同浓度下的表现，且在高浓度下毒性更低。

3.14 IND对人精子细胞AKT活性的影响

IND在15 μg/mL时使AKT活性升至121.4%，而SC79虽在低浓度下激活更强但在高浓度下毒性显著增大，IND则表现出更稳定的激活能力和更低的细胞毒性。

讨论与结论

研究人员指出，这是首次报道IND对α-淀粉酶和脂肪酶的抑制活性，以及对AMPK和AKT通路的激活作用。IND的多靶点生物活性使其在调控餐后高血糖、肥胖和胰岛素抵抗方面具有潜力。分子对接结果进一步证实了IND与各靶点的强结合亲和力。在人精子细胞实验中，IND有效促进了葡萄糖摄取和能量代谢，且在高浓度下毒性远低于两种阳性对照药物。结论部分强调，通过优化LB培养基可显著提高IND产量；IND在不同pH、温度和储存条件下具有良好稳定性，但对光敏感；IND具备抑制α-淀粉酶和脂肪酶、激活AMPK和AKT信号通路的能力，是调节糖脂代谢的潜在多功能天然色素，有望应用于营养保健品和药品领域。但研究人员也指出，仍需开展体内研究验证代谢效应、进行全面的毒性与安全性评估、开展药代动力学和生物利用度研究，并深入探究AMPK和AKT调节的分子机制。