《Molecular Ecology Resources》：Historical Plant Embryos as Alternative Sources of Ancient DNA for Whole Genome Sequencing
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自然历史和农业收藏包含数亿份按时间、空间和分类学分类的标本。自20世纪80年代首次成功分离古代DNA（aDNA）以来，这些馆藏（包括植物标本馆）已被广泛用于支持分类学、宏观进化和对人为活动遗传响应的研究。对植物标本而言，aDNA通常从叶片样本提取，且高度片段化
自然历史和农业收藏包含数亿份按时间、空间和分类学分类的标本。自20世纪80年代首次成功分离古代DNA（aDNA）以来，这些馆藏（包括植物标本馆）已被广泛用于支持分类学、宏观进化和对人为活动遗传响应的研究。对植物标本而言，aDNA通常从叶片样本提取，且高度片段化（典型长度为50–100 bp）。为优化检索数据量并减少破坏性采样，研究人员从一种非传统植物组织类型——种子胚——中分离DNA。研究人员开展全基因组测序（WGS），并比较同一标本胚与叶组织间测序DNA质量。研究人员评估三个物种的内源DNA比例、中位片段长度、每位点损伤比例（λ）、衰减速率（k）、核苷酸错误掺入和文库复杂度：栽培稻 Oryza sativa、野生稻 O. rufipogon 和野生大麦 Hordeum spontaneum。在 O. sativa 中，胚的内源含量和中位片段长度显著高于叶。优越的DNA保存可能归因于种子壳的保护作用，种子壳可能在热带采集的植物DNA保存中起重要作用。相反，在温带 H. spontaneum 中，组织类型对DNA质量影响极小。尽管胚尺寸微小，所有衍生基因组文库均高度复杂，足以进行深度全基因组测序。这些结果突出种子胚作为植物标本、经济植物学收藏和人类学博物馆收藏的有前景的替代aDNA来源。
自然历史和农业收藏包含数亿份按时间、空间和分类学分类的标本。全球近4800个植物标本馆保存超过4亿份标本，覆盖所有大陆已知植物分类群。自20世纪80年代首次成功分离古代DNA（ancient DNA，aDNA）以来，这些馆藏被广泛用于分类学、宏观进化和遗传响应研究。植物标本DNA通常高度片段化，典型长度50–100 bp，并发生化学损伤。采集和细胞死亡后，DNA先由胞内核酸酶和微生物活动降解，随后水解和氧化反应进一步降低完整性。标本制备和储存中的热处理、冷冻去污及过去化学防虫可加剧降解。最常见化学损伤是胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。植物标本DNA降解速度快于考古骨骼，且内源DNA与微生物/外源DNA混合比例变异大。叶片是最常用组织，但DNA质量和数量受年龄、分类群、来源等影响，有时叶片量不足。历史种子和胚也有研究，但整种子含储存化合物干扰DNA，且含母体种皮（2n）、混合胚乳（3n）和胚（2n）；只有胚代表后代真正二倍体基因型，细胞密集，储存和次生代谢物较低。因此，研究人员评估单粒种子胚用于全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）的可行性，并比较同一标本胚与叶的DNA质量，涵盖26份标本、两个水稻种和一个大麦种。研究人员从法国国家自然历史博物馆（NMNH）和英国皇家植物园邱园（RBGK）的植物标本中获得叶和种子。O. sativa 采自越南，O. rufipogon 采自泰国，H. spontaneum 采自西亚（伊拉克、约旦、叙利亚和土耳其）和阿富汗，年龄约30–200年。结果显示，从叶和单个胚成功回收gDNA，低至约40 pg降解aDNA也能建库并足以WGS。O. sativa 胚的内源含量和中位片段长度显著高于叶，可能因种子壳保护；温带 H. spontaneum 中组织类型影响小。所有胚来源文库高度复杂。该研究意义在于，种子胚可作为植物标本、经济植物学收藏和人类学博物馆收藏的aDNA替代来源，尤其叶片有限或加工严重损害DNA时。关键技术方法不超过250字：样本队列来自NMNH民族植物学收藏和RBGK，包括栽培稻 O. sativa、野生稻 O. rufipogon 和野生大麦 H. spontaneum，年龄约30–200年。关键技术为从干燥叶片和单粒种子胚分离基因组DNA（gDNA）；构建测序文库，在Illumina NovaSeq X+平台进行2×150 bp双端测序；生物信息学以 AdapterRemoval v2.3.4 合并读段和去接头，FastQC质控，bwa-aln v0.7.18 比对参考基因组，samtools v1.21 处理比对，preseq c-curve 评估文库复杂度，AMBER 检测C-to-T错误掺入，DeDup 去PCR光学重复，并通过回归估计λ和k。研究结果如下。3.1 DNA分离与文库构建：研究人员成功从三个物种叶和单个种子胚分离历史DNA，样本约30–200年。所有去壳谷粒均有可识别胚。gDNA浓度0.0015–22 ng/μL，总产量0.15 ng–2.2 μg。叶组织量与gDNA产量无线性关系；胚质量低于实验室天平检测限。尽管部分样本gDNA极低，仍足够建库和WGS。阴性对照大多非复杂读段比对参考基因组比例<0.04；两个内源比例0.096和0.074可能为测序index hopping，第二次测序无污染。3.2 内源含量、文库复杂度、核苷酸错误掺入与DNA片段化：通过比对参考基因组估计污染和内源比例。除一个野生大麦胚及两个野生大麦叶外，所有胚和 O. rufipogon、H. spontaneum 叶内源高83%–98%；O. sativa 叶内源低且可变约1.6%–37%；仅 O. sativa 胚显著高于叶（置换检验，p=3.66×10
?8）。文库复杂度：O. rufipogon 和 H. spontaneum 两组织高93%–99%；O. sativa 叶约70%–96%。C-to-T错误掺入：O. sativa 样本较高（至0.068），其他两物种多数样本0.006–0.03；组织差异可见但不显著。中位片段长度：Oryza 中胚比叶长，O. sativa 平均差18 bp（p=3.66×10
?3，Bonferroni校正α=0.0125），O. rufipogon 平均差13 bp（p=0.016，α=0.0125）；H. spontaneum 无显著差异。λ结果与中位长度一致：O. sativa 显著，O. rufipogon 可见不显著，H. spontaneum 无。k：三个物种叶片k均高于对应胚，表明叶衰减更快，但许多回归弱或不显著。O. rufipogon 胚呈强年龄–损伤关系（R
2=0.825，p=0.005），叶较弱；O. sativa 叶衰减更高且与年龄显著正相关（k=5.86×10
?4，R
2=0.606，p=0.013），胚较低且不一致；H. spontaneum 两组织衰减率较低（胚k=1.05×10
?4，叶k=2.58×10
?4），λ–年龄相关弱且不显著。结论：组织类型可影响 Oryza DNA衰减率，叶DNA可能比胚衰减快。3.3 全球收藏中历史作物种子材料评估：植物标本可能附种子，或在特殊胶囊、相关果实收藏中。种子不总存在，植物学家偏好花期。生物文化收藏通常关注利用部分，作物多为种子或果实，18–19世纪形成，服务于经济植物学、民族植物学、农学、生药学、食品科学等。植物标本材料可通过 Index Herbariorum 或 GBIF 识别；生物文化收藏通常知之甚少、目录不全，即使与植物标本馆同机构。Biocultural Collections Group 努力汇集管理者，但全面普查未完成。研究人员利用网络列出25个代表性生物文化收藏，显示全球可用；三个最大收藏在巴黎自然历史博物馆、英国皇家植物园邱园和圣彼得堡瓦维洛夫植物工业研究所。较小收藏更聚焦特定作物或地理。样本可为植物标本格式或玻璃罐、塑料盒等容器。通过馆藏调查得出：这些收藏是重要但未充分利用的历史作物种子资源。讨论总结：本研究主要测试植物胚WGS可能性，比较三个物种胚与叶。成功从两种组织及约200年单个胚回收gDNA；低至约40 pg降解aDNA构建文库，足以WGS。内源DNA比例主要受环境条件影响，也受组织特性影响；标本制备可快速耗尽内源DNA。三个物种代表谷类/草，一栽培两野生近缘，热带 Oryza 与温带 Hordeum。O. sativa 叶内源极低，而 O. rufipogon 叶高，提示 O. sativa 标本制备等特有过程造成叶DNA损失，厚种子壳提供结构保护，保存胚DNA；缺乏详细制备保存史限制结论。Oryza 两物种胚中位片段较长，O. sativa 显著，O. rufipogon 不显著可能样本量小。种子壳保护可缓解热带采集标本DNA降解；H. spontaneum 温带叶降解较轻，故组织差异不显著。O. sativa 三个样本mapped reads少于10,000，可能使λ和k不精确。研究开放历史植物材料尤其作物研究；其他植物胚可能也适用，但需测试；极小种子胚可能具挑战，低复杂度；次生代谢物多需注意，但多积累于胚乳而非胚，解剖精度关键。植物标本馆有局限：材料有限、作物采集少、缺文化数据。生物文化收藏优势：利用部分、种子果实、批量、文化数据。与基因库相比，种子通常无活力，但储存条件可保存aDNA。建议研究人员创意搜索，从本地收藏开始，广泛询问。应用需注意法律伦理，遵循CBD、名古屋议定书和ABS指南，并与当地有用植物守护者和所有者合作。研究结论翻译：总之，本研究证明从 O. sativa、O. rufipogon 和 H. spontaneum 单粒种子胚分离DNA并构建测序文库的可行性。在 Oryza 属中，胚在多项指标上持续优于叶片，而在野生大麦中两种组织均提供满意结果且无显著差异。胚代表从植物标本分离DNA的有前景替代来源，尤其当采集、制备和加工可能严重损害内源DNA质量时。这些发现突出单粒种子胚DNA分离在植物标本中的更广泛潜力，尤其当叶片组织有限时。此外，本研究为基因组研究开放了丰富但此前未充分利用的历史资源，包括种子库、经济植物学收藏、人类学博物馆和其他保存作物谷物的收藏。
