大鼠结肠Proopiomelanocortin（POMC）–β-Endorphin（β-END）系统：表达、应激上调及其与应激诱导内脏镇痛的相关性

《Neurogastroenterology & Motility》：Proopiomelanocortin (POMC)–β-Endorphin System in the Rat Colon: Expression, Up Regulation by Stress, and Correlation With Stress-Induced Visceral Analgesia

　　

背景：垂体proopiomelanocortin（POMC）–β-endorphin（β-END）系统可被下丘脑corticotropin-releasing factor（CRF）信号和应激激活。研究人员探讨该通路是否也在大鼠结肠中表达、受外周CRF和应激调控，并与应激诱导的内脏镇痛相关。
方法：通过RT-PCR评估POMC及前激素转化酶PC1/3和PC2转录本，并通过免疫组织化学检测未处理（na?ve）成年雄性Sprague–Dawley大鼠近端和远端结肠中POMC与β-END定位。在腹腔注射CRF（10 μg/kg）或生理盐水后1 h，以及对接受重复水逃避应激（rWAS）（1 h/天，连续10天）或对照处理的大鼠，在用非侵入性方法评估对结直肠扩张（CRD）的内脏运动反应（VMRs）后第11天，采用实时定量PCR定量近端结肠POMC mRNA。评估POMC基因表达与VMRs的相关性。
结果：POMC、PC1/3和PC2转录本在近端和远端结肠中检出。POMC和β-END免疫反应细胞定位在固有层和肠神经丛。CRF使POMC mRNA表达增加2.5倍。rWAS以压力依赖性方式降低对CRD的VMRs，在60 mmHg时降低达52%，并使POMC表达较对照增加10倍；POMC表达与累积VMRs呈负相关（r = ?0.655，p = 0.034）。
结论：大鼠结肠肠神经丛中POMC-β-END系统的表达，以及CRF/应激诱导的POMC上调和其与CRD镇痛反应的相关性，提示其在调节内脏痛中可能具有相关性。

应激 increasingly 被认为是内脏痛疾病发生和加重的重要因素，包括irritable bowel syndrome（IBS，肠易激综合征）。中枢corticotropin-releasing factor（CRF，促肾上腺皮质激素释放因子）信号是应激相关内脏痛反应的关键调节系统。 CRF及相关肽在应激时释放，通过CRF₁和CRF₂受体协调内分泌、自主和行为适应。在下丘脑–垂体轴中，应激释放的CRF经CRF₁受体作用于垂体促肾上腺皮质激素细胞，诱导proopiomelanocortin（POMC，阿黑皮素原）转录及β-endorphin（β-END，β-内啡肽）等POMC衍生肽产生，从而连接应激信号与内源性阿片通路。除中枢作用外，CRF信号广泛分布于gastrointestinal（GI，胃肠）道。啮齿类结肠表达CRF₁和CRF₂受体，局部CRF表达可被炎症刺激和应激上调；外周CRF受体激活影响动力、上皮屏障通透性、免疫活性和内脏敏感性。但外周CRF调节内脏伤害感受的下游机制仍不完全清楚。β-END由POMC经前激素转化酶PC1/3和PC2蛋白水解加工产生；POMC加工通路在脑和垂体已明确，而GI中早期证据显示POMC转录本存在于胃、十二指肠和结肠组织提取物，β-END免疫反应见于肠神经元、肠内分泌细胞和免疫细胞，PC1/3和PC2免疫反应见于人远端肛门直肠区。然而，结肠内POMC精确细胞来源仍不清楚，早期免疫组织化学解释受POMC翻译后加工和抗体交叉反应影响，且结肠POMC信号是否受外周CRF或慢性应激调节未知。stress-induced visceral analgesia（SIVA，应激诱导内脏镇痛）是研究应激信号与内源性阿片通路相互作用的模型。研究人员此前报告，repeated water avoidance stress（rWAS，重复水逃避应激）在避免手术和术后单笼饲养的啮齿类中可靠诱导对colorectal distension（CRD，结直肠扩张）的内脏镇痛，药理学研究显示应激诱导镇痛中有纳洛酮敏感成分。因此，本研究旨在表征大鼠结肠POMC–β-END系统，并分析其与rWAS相关内脏镇痛的关系。

研究人员检测近端和远端结肠POMC、PC1/3和PC2基因表达，检查全层和whole-mount制备中POMC与β-END免疫染色细胞定位，评估外周CRF信号激活和rWAS是否调节结肠POMC基因表达，以及这些变化是否与rWAS诱导的SIVA相关。结论表明，大鼠结肠存在功能性POMC–β-END系统，受外周CRF信号或重复心理应激动态调节；POMC和β-END主要定位肠神经丛，CRF和rWAS上调结肠POMC，且POMC表达与CRD的visceromotor responses（VMRs，内脏运动反应）负相关。该研究提示结肠存在内在CRF响应性POMC–β-END系统，可能局部调节内脏伤害感受，为应激相关内脏痛调制提供新的外周内源性机制。

关键技术方法：样本来源为Harlan Laboratory, San Diego, CA的成年雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠（265–297 g）。采用RT-PCR检测POMC、PC1/3和PC2转录本；免疫组织化学和全层/whole-mount免疫荧光定位POMC与β-END；腹腔注射CRF后1 h及rWAS（1 h/天，10天）后第11天，用实时定量PCR检测近端结肠POMC mRNA；以非侵入性方法记录CRD诱导的VMRs并评估相关性。

3.1 POMC、PC1/3和PC2 mRNA在大鼠结肠中的表达：通过两套分别靶向Pomc信号肽/外显子2–3区和编码β-END区外显子3的引物，在近端和远端结肠检测到预期大小产物，垂体阳性对照亦有相应条带；Pcsk1（PC1/3）和Pcsk2（PC2）在近端结肠、远端结肠和垂体检测到；内参基因Arp条带一致，测序证实产物与报道序列一致。结论：结肠表达POMC及加工酶PC1/3和PC2转录本。
3.2 POMC和β-END免疫反应在大鼠结肠中的细胞定位：通过全层免疫过氧化物酶和肠神经丛whole-mount免疫荧光，POMC免疫反应主要见于肌间神经丛，黏膜、黏膜下和肌层少或无；全mount中POMC见于黏膜下和肌间神经丛内神经元形态细胞。β-END在全层中显著见于黏膜下和肌间神经丛，也见于固有层细胞；全mount中β-END见于黏膜下和肌间神经丛内神经元形态细胞。阴性对照无染色。结论：POMC和β-END主要定位于肠神经丛，β-END还可见于固有层。
3.3 CRF和rWAS对大鼠近端结肠POMC mRNA表达的调节：通过腹腔注射CRF或生理盐水后1 h实时定量PCR，CRF使POMC mRNA较对照增加2.5倍（2.46±0.39 vs. 1.00±0.46，p < 0.05）；通过10天rWAS或非应激对照，在CRD后第11天检测，rWAS使POMC mRNA较对照增加10倍（10.05±3.14 vs. 1.00±0.33，p < 0.05）。结论：外周CRF和重复应激均上调近端结肠POMC mRNA。
3.4 rWAS后结肠POMC mRNA表达与CRD的VMR相关性：通过非侵入性VMR记录，对照大鼠在20、40和60 mmHg CRD时VMR随刺激强度增加；rWAS以压力依赖性方式降低VMR，在20和40 mmHg呈下降趋势，在60 mmHg显著降至非应激对照的52%，符合SIVA。Spearman相关分析显示结肠POMC mRNA表达与累积VMR显著负相关（r = ?0.655，p = 0.034），即较高POMC表达与较低内脏痛反应相关。

讨论总结：当前结果首次证明大鼠结肠存在功能性POMC–β-END系统，并受外周CRF信号或重复心理应激动态调节。结肠含POMC加工所需分子组件；两套引物、测序和垂体阳性对照支持真实POMC转录，PC1/3和PC2提示加工酶机制。蛋白层面，POMC和β-END主要定位肠神经丛，β-END也见固有层；POMC阳性细胞呈神经元形态，类似Dogiel Type II神经元，但因突起不清难以分类。CRF可在1 h内上调POMC，提示肠POMC系统快速激活；垂体CRF经CRF₁受体依赖cAMP刺激POMC转录，且外周CRF可激活肌间神经元并存在CRF₁表达，提示类似机制可能作用于结肠。尽管外周CRF通常促伤害感受，POMC上调可能代表应激时补偿性阿片机制，但可能不足以克服CRF的强促伤害作用，故总体仍为内脏痛觉过敏。rWAS使结肠POMC表达增加10倍，且与累积VMR负相关；由于检测近端而非远端结肠，排除CRD机械扩张直接局部效应；rWAS诱导的内脏镇痛对纳洛酮敏感，支持应激响应性POMC来源阿片系统参与。局限包括：未用HuC/D等泛神经元标记双标确认神经元身份，未明确神经元亚型，未证明β-END产生或分泌增加，相关性不能证明因果，需抑制POMC加工或阻断下游β-END信号，且仅研究雄性。研究结论：本研究识别出大鼠结肠中先前未被认识的CRF和应激响应性POMC–β-END系统。分子、解剖和功能发现表明结肠表达POMC及加工酶PC1/3和PC2，POMC和β-END细胞定位主要限于肌间和黏膜下神经丛，支持存在内在肠POMC-阿片加工通路。CRF和重复应激触发结肠POMC表达上调，并与CRD内脏痛反应呈负相关，提示该系统可能在调节内脏伤害感受中发挥作用。