细胞分裂素（CKs）通过抑制防御信号、减少防御物质积累并重编程初级代谢促进杨树对锈菌Melampsora larici-populina的易感性

《Plant, Cell & Environment》：Cytokinins Promote Rust Susceptibility in Poplar by Suppressing Defence Signalling, Reducing Defence Accumulation and Reprogramming Primary Metabolism

　　

细胞分裂素（cytokinins, CKs）经典上被认为是植物生长调节剂，但日益被认为参与植物-微生物相互作用。草本植物研究提示，CKs可作为信号分子在植物防御中发挥双重作用，既可限制也可促进病原菌感染。然而，其在树木-病原菌相互作用中的作用仍大体未被探索。在此，研究人员调查了黑杨（Populus nigra）在专性活体营养型病原菌Melampsora larici-populina感染期间的CK诱导、代谢与功能。研究人员发现，多数类异戊二烯CKs（isoprenoid CKs）在锈菌接种后迅速在黑杨叶片中积累，但在真菌增殖和产孢阶段下降。相反，杨树特异性芳香族CKs（aromatic CKs），如topolins，在整个感染过程中被诱导。外源施用占优势的类异戊二烯CK反式玉米素（trans-zeatin, tZ）和杨树特异性芳香族CK（topolins）显著增强锈菌定殖。升高的CKs减少抗真菌黄烷-3-醇（flavan-3-ols）以及防御相关激素，包括水杨酸（salicylic acid, SA）和茉莉酸类（jasmonates）的积累。此外，增加的CK水平，尤其是邻位拓扑林（ortho-topolin），显著增加游离氨基酸浓度，可能增强活体营养型锈菌的营养可利用性。综上，这些结果揭示杨树CKs削弱树木化学防御，同时增强宿主来源营养物的积累，从而促进锈菌感染。这些发现揭示了CKs在树木-病原菌相互作用中此前未被探索的作用。

研究背景与问题：细胞分裂素（cytokinins, CKs）是调控植物生长发育以及生物和非生物胁迫响应的植物激素。植物来源CKs分为类异戊二烯CKs（isoprenoid CKs）和芳香族CKs（aromatic CKs）。类异戊二烯CKs普遍存在，包括N⁶-(Δ²-isopentenyl)-adenine（iP）、trans-zeatin（tZ）、cis-zeatin（cZ）和dihydrozeatin（DHZ）及其衍生物；芳香族CKs如ortho-topolin、meta-topolin及其甲氧基衍生物和benzyladenine仅见于某些植物。杨树（Populus spp.）可合成topolin型芳香族CKs。CK生物合成多经质体甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径，由异戊烯基转移酶（IPTs）催化DMAPP与腺苷5′磷酸形成iP核苷酸，再经CYP735A羟化为tZ核苷酸，LONELY GUY（LOG）催化非活性CK核苷酸转为活性游离碱，CK氧化酶/脱氢酶（CKXs）不可逆降解CK。CK信号通过含CHASE结构域受体、组氨酸磷酸转移蛋白（HPTs）和type-B响应调节因子（type-B RRs）等传递。CK在防御中具有双重且依赖情境的作用：可经SA途径增强拟南芥对Pseudomonas syringae抗性，也可在烟草中不依赖SA刺激scopoletin和capsidiol积累，并调节JA信号；但在clubroot等互作中可增强易感性。杨树中CK参与形成层发育、叶序、根系和干旱响应，且前期研究发现Plectosphaerella populi感染可诱导杨树茎CK代谢物，tZ处理降低防御代谢物。杨树抗锈依赖flavan-3-ols等酚类次生代谢物，SA和jasmonates正调控抗菌黄酮生物合成。然而，CK是否影响这些化学防御并塑造杨树-锈菌互作尚不清楚。因此，研究人员开展本研究以解析CK在黑杨与专性活体营养型锈菌M. larici-populina互作中的功能。研究人员开展时间过程接种、CK定量、基因表达、外源CK处理、感染测定及防御代谢和初级代谢分析，发现CK代谢动态变化，外源tZ和topolins增强锈菌定殖，降低SA、jasmonates和flavan-3-ols积累，并增加游离氨基酸，表明CK通过削弱化学防御和重编程初级代谢促进锈菌易感。该工作揭示CK在树木-病原互作中的新角色，对理解木本植物免疫和营养-防御平衡具有重要意义。

关键技术方法（≤250字）：样本来自德国Jena Max Planck Institute for Chemical Ecology温室，包括黑杨（Populus nigra）基因型NP1和Fritzlar2，以及杂交杨（P. tremula × P. alba clone INRA 717-1B4）。研究人员以M. larici-populina孢子悬液（1×10⁵ spores mL^-1）接种叶片，设置对照；用LC-MS/MS定量CK、SA、jasmonates、flavan-3-ols、其他黄酮、游离氨基酸和可溶性糖；用RT-qPCR分析CK生物合成、分解代谢、响应基因、黄酮途径基因、MYB、WRKY、PR基因及真菌定殖；外源施用tZ和topolins后评估代谢、基因表达、锈菌定殖和防御代谢。统计采用ANOVA、t检验、Tukey检验等。

研究结果：
3.1 CK水平在黑杨叶片中常随锈菌感染增加，尤其在感染早期。通过7天感染时间过程LC-MS/MS定量，研究人员发现tZR和tZ在6 hpi显著增加，tZROG在6 hpi和3 dpi增加，iPR和iP在6 hpi增加，cZROG在6 hpi和3 dpi增加；DHZR、DHZ和DHZROG总体变化有限；ortho-topolin和meta-topolin在6 hpi和7 dpi显著增加。总体上，多种CKs在早期感染增加，在真菌生物营养生长和产孢阶段下降，而topolins在整个感染期被诱导。
3.2 CK生物合成（IPTs）、分解代谢（CKXs）和响应（RRs）基因在锈菌感染黑杨叶片中差异诱导。RT-qPCR显示，IPT2、IPT3、IPT5a和IPT6b在6 hpi多数上调，3 dpi部分下调，7 dpi均显著低于对照；CKX1全期降低，CKX4在6 hpi降低而7 dpi升高，CKX6在6 hpi升高；RR7和RR13在感染中下降。结果表明CK生物合成早期诱导、后期抑制，CK降解参与调节，且CK信号输出可能降低。
3.3 杨树将外源CK代谢为结构相关形式。外源tZ处理后，tZ、tZR和tZROG剂量依赖增加，DHZR不变，DHZ下降，DHZROG在10 μM tZ下增加，iPR不变，iP下降，topolin不变；外源topolins不改变类异戊二烯CK谱，相应topolin增加，且一种topolin不影响另一种。结果表明外源CK可被吸收代谢，但不同CK类间转化有限。
3.4 预先用tZ和topolins处理的黑杨更易感锈菌。处理1天后接种，6 dpi用RT-qPCR定量真菌定殖，发现tZ预处理增加锈菌定殖，ortho-topolin或meta-topolin预处理也增加定殖。结果表明类异戊二烯和芳香族CKs均负向影响黑杨对M. larici-populina的防御。
3.5 CK处理的黑杨叶片氨基酸浓度增加而可溶性糖无重大变化。LC-MS/MS显示，tZ处理对葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖影响不大，topolins处理下糖也基本不变，meta-topolin使蔗糖略降；tZ处理多数氨基酸不变，仅苏氨酸降低和亮氨酸增加；topolins处理多数氨基酸显著增加，ortho-topolin效果更强。结果表明CK尤其topolins增加游离氨基酸可利用性，可能有利于活体营养型锈菌。
3.6 升高CK水平降低杨树叶片SA和jasmonates积累。LC-MS/MS显示，2.5 μM tZ降低游离SA，10 μM tZ无显著影响，SAG降低；tZ处理下cis-OPDA显著降低，JA略降但不显著，JA-Ile和OH-JA-Ile显著降低；杂交杨经tZ处理后总SA和jasmonates显著降低；topolin处理降低游离和糖基化SA，并降低cis-OPDA、JA、JA-Ile和OH-JA-Ile。结果表明类异戊二烯和芳香族CKs负调控SA和jasmonate积累。
3.7 CKs负调节杨树叶片抗菌flavan-3-ols积累。LC-MS/MS显示，2.5 μM tZ降低catechin、gallocatechin、proanthocyanidin二聚体和naringenin，quercitrin、rutin和taxifolin不受影响；杂交杨中tZ降低flavan-3-ols及其他黄酮。tZ加锈菌处理后，DFR、LAR、ANR等晚期黄酮生物合成基因和MYB115下调，PR1和PR2上调，WRKY不变；topolin处理降低flavan-3-ols单体和二聚体以及naringenin、taxifolin，ortho-topolin作用强于meta-topolin。结果表明CK抑制抗菌flavan-3-ols积累，可能削弱化学防御。

讨论部分总结：
4.1 锈菌感染期间CK代谢动态变化。活性CKs在6 hpi快速增加，对应真菌穿透和吸器形成；后期尤其在定殖和uredinia形成时tZ下降，非活性CK结合物积累。杨树特异性topolins全程积累，提示CK亚类作用不同。IPT表达与早期CK增加一致，CKXs多数下调，RR7和RR13下调，提示锈菌可能干扰宿主CK感知或信号转导。
4.2 外源CK激活信号并促进锈菌易感。外源tZ部分转为其他tZ型CK，DHZ和iP亚类下降，CK分解基因被诱导，CK响应RR基因强烈诱导。外源类异戊二烯或芳香族CK不相互影响，提供独立研究工具。外源CK显著增加锈菌易感性，与CK在某些系统中抗虫、抗细菌或抗病毒作用不同，显示情境依赖；M. larici-populina是否产CK尚 unlikely，因未检测到CK合成基因和孢子CK。
4.3 CK抑制SA和JA介导的化学防御。tZ和topolins降低SA和jasmonates尤其JA-Ile，SA和JA在杨树中协同激活抗锈防御；早期CK诱导可能拮抗SA/JA防御。CK处理降低flavan-3-ols并下调黄酮生物合成基因和调节转录因子，削弱树木化学防御。直接或间接机制仍需遗传和救援实验。
4.4 CK可能增强活体营养锈菌营养可利用性。可溶性糖基本不变，芳香族CK尤其ortho-topolin显著增加游离氨基酸。活体营养病原从活细胞经吸器获取营养，氨基酸是重要氮源。CK调节源-库关系，可能刺激营养动员和库建立，创造有利代谢环境。topolin作用强于tZ，ortho-topolin强于meta-topolin，且ortho-topolin持续积累可能延长代谢重编程。
4.5 结论与未来展望：CK信号在杨树-锈菌互作中重要。升高CK抑制防御激素和抗菌黄酮，增加游离氨基酸，协调代谢和激素变化，削弱化学防御，有利M. larici-populina定殖。局限是外源CK可能高于生理浓度，且实验为受控环境幼树，需田间成熟树验证生态相关性。未来应研究锈菌是否主动操纵杨树CK代谢和信号，并利用改变CK代谢或信号的基因工程杨树解析CK信号、防御激素和黄酮抗性机制。

研究结论翻译：研究人员的发现表明，CK信号在调节杨树-锈菌相互作用中发挥重要作用。升高的CK水平抑制防御激素和抗菌黄酮的积累，同时增加宿主来源营养物如游离氨基酸的可利用性。这些协调的代谢和激素变化与杨树化学防御降低相关，并为专性活体营养型锈菌M. larici-populina的定殖创造有利条件。当前研究的一个限制是外源CK施用可能导致活性CK水平高于杨树组织中的生理浓度。此外，所有实验均在受控环境条件下使用幼龄杨树进行，需要在田间条件下用成熟树木进一步研究，以确定这些发现的生态相关性和适用性。未来研究应调查锈菌是否主动操纵杨树CK代谢和信号通路以促进宿主定殖。此外，改变CK代谢或信号的基因工程杨树株系可为解析CK信号、防御激素途径和黄酮介导的真菌抗性之间的机制联系提供有价值工具。