《Plant, Cell & Environment》：RAP2.3 Is Required for MYB51 and SIGMA3 Expression During the Response of Arabidopsis thaliana to Multifactorial Stress Combination
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在自然界中，植物同时或序贯遭受多种环境胁迫因子。近期研究揭示，当三种或更多胁迫因子同时影响植物时（称为“多因子胁迫组合”；multifactorial stress combination，MFSC），即使参与MFSC的每个单一胁迫强度较低，植物存活率仍下降。
在自然界中，植物同时或序贯遭受多种环境胁迫因子。近期研究揭示，当三种或更多胁迫因子同时影响植物时（称为“多因子胁迫组合”；multifactorial stress combination，MFSC），即使参与MFSC的每个单一胁迫强度较低，植物存活率仍下降。研究人员先前鉴定RAP2.3为拟南芥（Arabidopsis thaliana）存活所需的关键转录因子（transcription factor，TF），特异于盐+过量光+热胁迫（salt + excess light + heat stress，S + EL + HS）的MFSC。此处，研究人员报告RAP2.3调控SIGMA3表达，SIGMA3是一种核编码因子，引导质体RNA聚合酶至特定质体启动子；还调控MYB51表达，MYB51是参与硫代葡萄糖苷（glucosinolate）代谢和氧化胁迫响应的关键胁迫响应TF；且特异于S + EL + HS的MFSC。类似rap2.3突变体，myb51和sig3突变体在S + EL + HS的MFSC下特异性显示显著低存活率。基于MYB51基因调控网络（gene regulatory network，GRN）分析和茉莉酸（jasmonic acid，JA）突变体表征，研究人员进一步揭示，抑制JA信号可能在S + EL + HS条件下促进植物存活中起重要作用。研究人员的发现揭示了植物对MFSC响应的额外层面，并鉴定出用于培育增强气候变化耐受性的作物的潜在靶标。
研究背景：自然界中植物常同时或序贯遭遇多种胁迫。两种或以上胁迫构成“胁迫组合”，三种及以上为多因子胁迫组合（multifactorial stress combination，MFSC；三种及以上胁迫因子同时或序贯影响植物）。既往研究提出MFSC原则：随着胁迫复杂性增加，植物生理表现、生长和存活显著下降，即使各单一胁迫强度较低。气候变化和污染加剧使MFSC研究更迫切，以鉴定MFSC特异基因和通路，培育抗逆作物。此前研究鉴定bHLH35特异参与拟南芥在盐（salt，S）+过量光（excess light，EL）+热胁迫（heat stress，HS）MFSC下的存活，并调控LBD31和RAP2.3表达；但RAP2.3在MFSC中的作用尚不清楚。本研究围绕RAP2.3展开，发现其高表达导致S + EL + HS特异性敏感，并鉴定MYB51和SIGMA3为下游调控因子，同时提示JA信号抑制与MFSC存活相关，为理解植物MFSC响应提供新层面和育种潜在靶标。
关键技术方法：研究人员使用拟南芥Col-0野生型（WT）及T-DNA插入突变体，包括rap2.3_1（SALK_054382）、rap2.3_2（CS470425）、rap2.3_3（SALK_040902）、myb51_1（CS924242）、myb51_2（CS306634）、sig3_1（CS879277）、sig3_2（SALK_009166C）等；突变体种子来自拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）。在? MS培养基上设置对照及Cd、EL、HS、S、百草枯（paraquat，PQ）单胁迫和所有可能组合，统计存活率，并进行Fv/Fm成像。对WT和rap2.3_1在S、EL、HS所有组合下进行RNA-Seq（三生物学重复，NovaSeq 6000 PE150），开展差异表达、GO/KEGG、GRN（DIANE）、启动子motif（MEME/FIMO）、qRT-PCR、RAP2.3过表达株、EMSA和NO成像分析；RNA-Seq数据存于GEO GSE330879。
研究结果：
3.1 rap2.3突变体在5种胁迫MFSC下的表征：研究人员将WT和两个rap2.3突变体置于五种低水平非生物胁迫[盐（S；50 mM NaCl）、过量光（EL；700 μmol m
?2 s
?1）、热胁迫（HS；33°C）、百草枯（PQ；0.05 μM）和/或镉（Cd；5 μM CdCl
2）]的所有组合。结果显示，rap2.3突变体特异对S + EL + HS敏感，对包含S + EL + HS的更高阶MFSC也敏感，但WT同样如此；PQ + Cd + EL + HS不影响WT或rap2.3；表明S加入EL + HS增强rap2.3易感性。naringenin未恢复rap2.3存活，提示其致死原因可能不同于bhlh35突变体的活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累机制。
3.2 RAP2.3表达升高的拟南芥植株对S + EL + HS的MFSC敏感：两个rap2.3突变体的T-DNA插入位于5'或3'非翻译区（UTR）。qRT-PCR表明，rap2.3_1和rap2.3_2中RAP2.3基础转录本水平高于WT，且在S + EL + HS下进一步升高。35S-CaMV驱动的RAP2.3过表达株（RAP2.3-OE）也显示对S + EL + HS敏感，并改变一氧化氮（nitric oxide，NO）积累。rap2.3_3无RAP2.3高表达且无MFSC敏感表型。结果提示，RAP2.3高表达可能克服N-degron降解，导致异常抑制或激活某些遗传程序，从而增强MFSC敏感性。
3.3 WT和rap2.3_1在MFSC期间的转录组学分析：RNA-Seq读段比对支持rap2.3_1中RAP2.3转录本在对照和所有胁迫条件下升高。差异表达分析显示，各胁迫及组合下超过2800个转录本改变。Venn图和UpSet图表明，WT中改变而rap2.3_1中未改变的转录本，以及rap2.3_1中改变而WT中未改变的转录本，在不同胁迫/组合间无重叠，提示RAP2.3在不同胁迫条件下具有独特调控功能。
3.4 WT和rap2.3_1在S + EL + HS条件下的比较转录组学分析：GRN分析鉴定312个与RAP2.3功能相关的转录本，分为8个簇；第7簇富集黄酮代谢、硫代葡萄糖苷生物合成、非生物胁迫响应、表观调控和乙烯信号。Class I（WT改变而rap2.3_1不改变）含1436个转录本，Class II（rap2.3_1改变而WT不改变）含2593个转录本。启动子含RAP2.3 DNA结合元件的Class I基因包括MYB51、WRKY6、SIGMA3、ROS/氧化还原相关蛋白、DNA修复、MAPK级联、渗透胁迫及激酶/磷酸酶等；Class II包括核糖体蛋白、磷酸酶、激酶、金属结合蛋白、钙感受蛋白、发育相关蛋白和WRKY33等。
3.5 MYB51和SIGMA3对MFSC条件下植物存活必需：研究人员测试10个基因的两个独立纯合突变体在对照、S、EL、HS和S + EL + HS下的存活。myb51和sig3突变体特异对三胁迫MFSC敏感，而对单个胁迫不敏感；mvq1和phl13也敏感，但本研究聚焦MYB51和SIGMA3。sig3在MFSC下Fv/Fm受损。EMSA证明RAP2.3结合MYB51和SIGMA3启动子；MYB51和SIGMA3在WT中受MFSC抑制，而在rap2.3_1中该抑制被阻断。由此提出层级：bHLH35调控RAP2.3，RAP2.3调控MYB51和SIGMA3，四者均促进MFSC下植物存活。
3.6 MYB51基因调控网络分析揭示JA信号在植物MFSC响应中的潜在作用：MYB51 GRN分为4簇，第6簇富集胁迫激素和信号转导过程，包括JA信号及硫代葡萄糖苷生物合成；第3簇富集温度响应、生长素信号和代谢途径。MYB51和/或RAP2.3 DNA结合元件存在于多个JA生物合成基因启动子中。rap2.3_1在S + EL + HS下JA生物合成/功能相关转录本JAR1、ACX3、OPR3、OPCL1和CYP94B1上调。jar1和coi1突变体较WT更耐S + EL + HS，提示JA通路激活与敏感相关，其抑制促进MFSC存活。
讨论部分总结：RAP2.3属于AP2/ERF第VII组，参与厌氧、病原、气孔、发育及NO、脱落酸、JA和赤霉素信号，并受N-degron–E3泛素连接酶途径降解。rap2.3_1和rap2.3_2中RAP2.3高表达与S + EL + HS敏感相关，过表达株也敏感且NO改变，rap2.3_3无高表达则表型似WT。原文提出RAP2.3积累可能负调控存活所需通路或正调控敏感通路。SIGMA3和MYB51在WT中受抑制，在rap2.3_1中未被抑制；二者突变体均对S + EL + HS敏感，且RAP2.3结合其启动子。SIGMA3引导质体RNA聚合酶至特定启动子，主要转录psbN，参与光系统II（photosystem II，PSII）组装和光抑制修复；MYB51为R2R3-MYB转录因子，调节吲哚族硫代葡萄糖苷（indolic glucosinolates，IGs）合成，并与氧化胁迫响应相关。JA通路激活与rap2.3_1敏感相关，coi1和jar1更耐S + EL + HS；原文提出乙烯与JA信号在MFSC中可能拮抗，RAP2.3功能改变可能抑制乙烯通路并激活JA通路。
研究结论翻译：研究人员的发现揭示，RAP2.3在植物对S + EL + HS的MFSC耐受中发挥重要作用；该TF过表达阻止了SIGMA3下调，SIGMA3特异参与S + EL + HS下PSII功能，也阻止了MYB51下调，MYB51可能参与MFSC下JA和IGs/GSLs信号。RAP2.3的这一功能提示其作为SIGMA3和MYB51表达激活因子，且其结合二者启动子支持该角色。因此，研究人员的发现定义了植物在MFSC下代谢和功能的一个方面，不同于bHLH35所定义者。除bHLH35控制的类黄酮和ROS代谢外，SIGMA3调控的光合作用，和/或MYB51潜在控制的JA和/或IGs/GSLs信号，也与MFSC下植物存活相关。未来研究可检验RAP2.3是否作为其他MFSC耐受相关通路的抑制子或激活子。
