《Plant, Cell & Environment》：Hydroxycinnamic Acid Amides Emerge as Multifunctional Molecules Involved in Regeneration and Volatile Signalling During Wound Responses
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羟基肉桂酸酰胺（hydroxycinnamic acid amides，HCAAs）是苯丙烷来源的代谢物，传统上被认为在植物-病原物互作中发挥抗菌防御和细胞壁加固的功能。然而，它们在植物对机械损伤响应中的作用，特别是在伤口愈合和损伤诱导信号传导中的贡献，仍
羟基肉桂酸酰胺（hydroxycinnamic acid amides，HCAAs）是苯丙烷来源的代谢物，传统上被认为在植物-病原物互作中发挥抗菌防御和细胞壁加固的功能。然而，它们在植物对机械损伤响应中的作用，特别是在伤口愈合和损伤诱导信号传导中的贡献，仍知之甚少。本研究利用35S::THT体系，在该体系中，酪胺羟基肉桂酰转移酶（tyramine hydroxycinnamoyl transferase，THT）——控制HCAAs生物合成的关键酶——被过表达，研究了番茄（Solanum lycopersicum）中损伤诱导的响应。通过整合代谢物谱分析、基因表达分析、共聚焦显微镜、抗氧化能力测定和挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）分析，研究人员鉴定了机械损伤后的局部和系统性响应。与野生型（WT）相比，35S::THT株系在损伤后表现出更强的HCAAs积累，游离酰胺水平持续升高，且损伤后细胞壁结合组分中酪胺来源的酰胺积累增加，这与损伤部位显著的结构强化相关。研究观察到维管木质化增强、栓质化（suberization）增加和胼胝质（callose）沉积，这些变化共同促进了组织再生能力的提升或与增强的组织再生能力相关。这些结构变化伴随着氧化还原相关响应的改变，支持HCAAs在伤口修复过程中调节氧化平衡的作用。除局部效应外，35S::THT株系还释放特定的损伤响应性VOC混合物，该混合物能够在没有直接损伤的情况下诱导邻近野生型植株中防御相关基因的表达，表明HCAAs在空气传播信号传导和防御启动（defence priming）中发挥作用。总之，这些结果表明，以HCAAs水平升高为特征的代谢背景与番茄损伤响应中结构强化、氧化还原响应、再生和挥发性介导的通讯的协调变化相关。这些观察结果支持HCAAs可能作为连接机械胁迫局部和系统性响应的关键整合组分这一观点。
**论文解读文章**
**一、研究背景与科学问题**
植物作为固着生物， constantly面临食草动物啃食、风雹霜冻等恶劣气候以及人类活动造成的机械损伤。损伤事件触发复杂的生理、生化和分子响应网络，旨在减轻伤害、恢复组织完整性并确保生存。损伤响应始于机械损伤的感知和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的检测，随后引发细胞内钙离子水平快速升高、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生以及转录网络的激活。茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水杨酸（salicylic acid，SA）和脱落酸（abscisic acid，ABA）等植物激素协调局部和系统性防御响应及组织修复机制。
在植物防御体系中，次级代谢产物的产生至关重要。其中，酚类化合物不仅作为抗菌和抗氧化剂，还作为木质素、栓质和单宁等结构聚合物的前体，增强组织强度并赋予植物对机械损伤和环境胁迫的抗性。羟基肉桂酸酰胺（hydroxycinnamic acid amides，HCAAs）是苯丙烷途径的一个特殊分支，由羟基肉桂酰辅酶A硫酯与生物胺（如酪胺或腐胺）缩合形成。HCAAs在植物防御中具有双重作用：结构上，它们参与细胞壁加固，增强对机械胁迫和病原体攻击的抗性；功能上，它们表现出抗菌和抗氧化活性。酪胺羟基肉桂酰转移酶（tyramine hydroxycinnamoyl transferase，THT）催化HCAAs生物合成的最后一步，是调控这些化合物积累的关键酶。与参与多个代谢分支的上游酶相比，THT为操纵HCAAs水平提供了更特异的干预点。已有研究表明，过表达THT的转基因番茄植株（35S::THT）在叶片、花和果实中组成型积累香豆酰酪胺（CT）和阿魏酰酪胺（FT），并在病原体侵染时表现出更强的抗性。然而，尽管机械损伤已被证明可诱导CT和FT的积累，HCAAs在损伤诱导信号传导和组织修复中的功能意义仍是一个悬而未决的重大问题。基于此，本研究利用35S::THT体系作为代谢模型，旨在探究HCAAs积累在机械损伤响应中的功能后果。
**二、技术方法概述**
研究人员以番茄（Solanum lycopersicum）Money Maker背景的35S::THT转基因株系及其相应野生型（WT）亲本系为材料，对4周龄幼苗（4-5片真叶）进行机械损伤处理（用齿状镊子在叶片沿脉制造5处伤口），24小时后采集样品。研究整合了多种技术手段：利用RT-qPCR分析损伤信号相关基因表达；通过非靶向UPLC-MS和靶向UHPLC-MS对可溶性和细胞壁结合酚类化合物进行定性和定量；采用GC-MS进行挥发性有机化合物（VOCs）分析；利用UHPLC-MS定量植物激素；通过DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性；运用组织化学染色（间苯三酚、碱性品红、金胺O、苯胺蓝）结合明场和共聚焦显微镜观察木质素、栓质和胼胝质的沉积；通过活体叶片微穿孔试验和离体下胚轴/子叶外植体培养评估伤口愈合和组织再生能力；使用密闭舱共居体系进行植物间通讯实验。
**三、研究结果**
**3.1 35S::THT株系在JA和ABA水平不变的情况下显示损伤响应基因表达的选择性变化**
在野生型（WT）植物中，损伤显著上调THT、PAL5和LOX-D的表达，而35S::THT株系中THT和PAL5呈组成型高表达，损伤后无进一步显著诱导。相反，JA响应标记基因TCI21在两种基因型中均保持强烈的损伤诱导性，且基础表达水平无显著差异。尽管损伤后两种基因型的JA和ABA水平均显著升高，但35S::THT株系中的积累与损伤WT无差异。这表明THT过表达与某些生物合成基因（如PAL5和LOX-D）的表达改变相关，而JA响应信号传导基本保持不变。
**3.2 机械损伤与35S::THT背景下可溶性和细胞壁结合HCAAs增强积累相关**
非靶向LC-MS结合主成分分析（PCA）显示，基因型和处理的分离明显，损伤的35S::THT样品聚类于PC1正区和PC2负区。载荷图分析表明，酚酰胺相关特征（尤其是CT、CD、FT、FD）是造成这种差异的主要贡献者。靶向定量结果显示，WT中损伤诱导CT、CO和FT的显著积累，而35S::THT株系中所有六种可溶性HCAAs（CT、CO、CD、FT、FO、FD）在损伤后均显著高于WT。在细胞壁结合组分中，WT损伤后仅FT显著增加，而35S::THT株系中FT、CT和CO均显著增加，表明其向细胞壁掺入这些化合物的能力增强。
**3.3 HCAAs过度积累植株表现出增强的维管木质化、栓质沉积和胼胝质积累**
组织化学染色显示，WT在损伤后维管束木质化增强，而35S::THT株系即使在未损伤时也表现出更厚、木质化程度更高的维管束，并在损伤后维持强且连续的木质化。共聚焦显微镜进一步证实，35S::THT株系在未损伤时就存在木质素和栓质的维管沉积，损伤后进一步增强。苯胺蓝染色和荧光定量显示，35S::THT株系损伤位点的胼胝质积累显著高于WT。这些结果表明，THT过表达增强了基础和损伤诱导的结构强化。
**3.4 HCAAs过度积累植株表现出组成型升高的抗氧化能力**
DPPH自由基清除实验显示，WT损伤后抗氧化能力显著增强，而35S::THT株系在未损伤条件下即具有与损伤WT相当的抗氧化能力，损伤后仅略有增加。过氧化物酶（POD）基因表达模式与此一致：WT中损伤诱导POD表达上调，而35S::THT中POD无论损伤与否均维持高水平表达。
**3.5 HCAAs过度积累植株促进伤口愈合和愈伤组织再生**
伤口愈合试验表明，35S::THT株系在损伤后7天的伤口面积-周长比已达到WT在14天时的水平，表明愈合过程加速。离体培养试验显示，35S::THT下胚轴和子叶外植体的愈伤形成率均显著高于WT。分子分析表明，再生相关转录因子WIND1（WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATION 1）在35S::THT外植体中显著上调。激素测定发现，35S::THT株系的基础吲哚-3-乙酸（IAA）水平显著高于WT，而细胞分裂素水平无差异。
**3.6 35S::THT系释放的VOCs与WT受体植株中防御基因表达改变相关**
植物间通讯实验显示，暴露于未损伤35S::THT释放的VOCs的WT受体植株，其TCI21和PR1表达均显著上调；而暴露于损伤35S::THT释放的VOCs的受体中，PR1表达相对于未损伤35S::THT处理组下降。这表明35S::THT株系即使未损伤也释放具有防御激活能力的挥发性信号。
**3.7 基础和损伤诱导的VOC释放谱在WT和35S::THT之间不同**
GC-MS分析显示，PCA中PC1（45.1%方差）区分损伤状态，PC2（17.8%方差）区分基因型。损伤的WT主要释放经典的绿叶挥发物（GLVs），如Z-3-己烯醛、1-戊烯-3-酮和Z-3-己烯基丁酸酯；损伤的35S::THT则释放E-2-庚烯醛、E-2-辛烯醛、E-2-癸烯醛、2-戊基呋喃等；未损伤的35S::THT特异释放多种单萜类（桧烯、α-松油烯、D-柠檬烯、β-伞花烃）和E-2-壬烯醛。热图分析揭示了三个不同的聚类：损伤相关VOC簇（富集于损伤WT）、基因型相关VOC簇（富集于35S::THT背景的单萜类）和损伤35S::THT特有簇。
**3.8 WT和35S::THT释放的挥发性信号在防御信号传导能力上存在差异**
外源挥发性化合物处理实验表明，Z-3-己烯醛（WT损伤特征性挥发物）显著诱导TCI21表达；E-2-庚烯醛（损伤35S::THT特征性挥发物）不诱导TCI21；柠檬烯（未损伤35S::THT特征性挥发物）对TCI21有诱导趋势但未达显著水平。在PR1表达方面，E-2-庚烯醛和柠檬烯处理均显著诱导PR1上调。这揭示了不同基因型释放的VOCs在防御信号传导能力上的差异。
**四、总结讨论与研究结论**
讨论部分指出，35S::THT株系表现出损伤相关转录响应的选择性改变，同时保持完整的JA和ABA信号传导，这是首次报道35S::THT植物中JA和ABA水平。HCAAs过度积累与细胞壁结构增强相关，包括木质素、栓质和胼胝质的协调沉积，反映了HCAAs在结构防御中的综合作用。组成型升高的抗氧化能力与伤口韧性相关，HCAAs可能在维持氧化还原平衡中发挥作用。增强的愈合和再生能力与WIND1表达上调和IAA水平升高相关，表明HCAAs积累可能与细胞重编程和再生能力增强有关。VOC分析显示，THT过表达重塑了损伤诱导的挥发性释放谱，且未损伤的35S::THT释放的VOCs足以诱导防御基因表达，但效果由特定VOC混合物的组合作用介导而非单一化合物。研究结论表明，HCAAs作为多功能分子，连接局部防御、组织修复和空气传播信号传导，在机械胁迫下发挥整合作用。这项研究揭示了HCAAs在植物损伤响应中的新功能，为理解植物如何整合代谢、结构和信号传导策略以应对环境挑战提供了重要见解。
