激光捕获显微切割结合转录组分析揭示红树植物白骨壤盐腺的泌盐机制

《The Plant Journal》：A laser capture microdissection-based transcriptome analysis on salt glands highlights salt secretion mechanism in mangrove plant Avicennia marina

摘要专业翻译 盐腺（salt glands）发育于泌盐红树植物白骨壤（Avicennia marina）叶片表皮，专门负责盐分分泌，对于提高其在高盐生境中的存活率至关重要。然而，A. marina的泌盐机制至今仍知之甚少。本研究采用激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）技术从A. marina上表皮分离盐腺，随后进行转录组测序（RNA-Seq），比较分析0 mM NaCl和400 mM NaCl处理下盐腺的基因表达谱。此外，利用非损伤微测技术（non-invasive micro-test technology, NMT）实时测定单个盐腺的Na+和Cl?外排速率；应用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察亚细胞结构变化；并通过异源表达实验对候选基因进行功能验证。结果表明，400 mM NaCl处理导致盐腺Na+和Cl?通量增加，其中Na+外排速率达2389 pmol cm?2 s?1，Cl?外排速率达1652 pmol cm?2 s?1。此外，在400 mM NaCl处理的A. marina叶片盐腺分泌细胞中，研究人员发现线粒体密度和囊泡数量显著增加。LCM-RNAseq共鉴定出1741个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），这些基因显著富集于囊泡运输（vesicle trafficking）、离子转运（ion transport）、相容性溶质运输（compatible solute transport）、基于水通道蛋白的水分运输（aquaporins-based water transport）、激素信号传导（hormone signaling）、细胞壁及角质层蜡质生物合成（cell wall and cuticle wax biosynthesis）等相关通路。功能验证表明，AmNHX2（Na+/H+逆向转运蛋白）、AmCLC-a（氯离子通道）和AmSCAMP1（分泌性载体膜蛋白）在酵母、烟草或拟南芥中异源表达后显著增强了耐盐性，并参与Na+/Cl?转运或囊泡形成与运输。综上所述，本研究揭示了A. marina盐腺通过多条途径（包括离子转运、囊泡运输、渗透调节和细胞壁可塑性）协同响应盐胁迫的分子机制，为理解泌盐红树植物的耐盐机制提供了重要见解。

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一、研究背景与科学问题

滨海盐碱生态系统（包括盐沼和红树林）中的植物必须应对高盐环境。泌盐红树植物已进化出多种适应策略，如根部拒盐和叶片泌盐。根据有无盐腺，红树植物大致分为拒盐型和泌盐型两类。拒盐型红树通过根皮层细胞的超滤作用排除过量盐分，例如拒盐红树Rhizophora mangle木质部汁液的盐浓度仅为海水的十分之一。泌盐型红树除根部拒盐外，还可利用叶片中特化的泌盐结构——盐腺来提高耐盐性。三种泌盐红树的泌盐能力排序为A. marina > Aegiceras corniculatum > Acanthus ilicifolius，与其耐盐性顺序一致，表明叶片盐腺在介导泌盐红树耐盐性中发挥重要作用。

已有研究表明，盐腺泌盐是一个耗能过程，H⁺-ATPase和Na⁺/H⁺逆向转运蛋白参与盐腺的Na⁺分泌。例如，A. germinans盐腺中的H⁺-ATPase分布于分泌细胞的细胞质膜上，H⁺-ATPase抑制剂最终可抑制盐腺的Na⁺分泌。Guo等证明质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（SOS1）参与Karelinia caspia盐腺的Na⁺分泌，沉默KcSOS1导致盐腺Na⁺分泌速率降低。此外，盐处理后Chenopodium quinoa盐囊泡中液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（NHX）的转录水平显著上调，盐分去除能力也随之增强。水分保持和相容性溶质积累在盐腺泌盐过程中同样重要。然而，此前研究使用的材料主要来自叶片或表皮而非盐腺本身，难以准确评估盐腺在耐盐性中的作用，特别是盐诱导的盐腺基因表达谱尚不清楚。激光捕获显微切割（LCM）结合RNA-Seq技术能够对特定组织或细胞进行灵敏的全基因组基因表达分析，但此前尚未有研究利用LCM-RNAseq分析盐腺的泌盐机制。

A. marina是最耐盐的红树植物之一，适应在海水盐度10–35‰的生境中生长繁殖，其叶片表面常覆盖盐晶体。在A. marina中，盐腺由收集细胞（collecting cells）、柄细胞（stalk cells）、分泌细胞（secretory cells）和角质层（cuticle）组成。盐腺分泌排盐效率高，使地上部敏感组织维持相对较低的盐离子浓度。本研究旨在通过多种技术手段系统解析A. marina盐腺的泌盐机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用扫描电子显微镜结合X射线能谱（SEM-EDAX）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和非损伤微测技术（NMT）研究NaCl处理下A. marina叶片盐腺的泌盐表型、叶片Na⁺和Cl^?含量、Na⁺和Cl^?分泌速率及盐腺Na⁺和Cl^?通量；利用透射电子显微镜（TEM）比较对照与盐处理植物盐腺的细胞学差异；通过LCM-RNAseq分析盐处理下盐腺的转录组特征；最后对三个选定的差异表达基因AmNHX2、AmCLC-a和AmSCAMP1在酵母、烟草和拟南芥中进行功能验证。

研究得出以下主要结论：400 mM NaCl处理30天后叶片表面盐晶体最为明显，Na⁺和Cl^?分泌速率达到最大值，分别为57.5 mg m^?2 day^?1和39.9 mg m^?2 day^?1；NMT测定显示400 mM NaCl处理下盐腺Na⁺和Cl^?外排速率分别达2389 pmol cm^?2 s^?1和1652 pmol cm^?2 s^?1；TEM观察发现盐处理植物盐腺分泌细胞中囊泡数量增多、线粒体密度增加，柄细胞与分泌细胞之间的胞间连丝更加丰富；LCM-RNAseq鉴定出1741个差异表达基因（1053个上调、688个下调），富集于离子转运、囊泡运输、水分与相容性溶质运输、激素信号、细胞壁和角质层蜡质生物合成等通路；功能验证表明AmNHX2、AmCLC-a和AmSCAMP1在异源表达系统中显著增强耐盐性，参与Na⁺/Cl^?转运或囊泡形成与运输。此外，研究人员鉴定出盐腺特异性HD-ZIP转录因子AmHAT2，并通过AlphaFold3预测和双荧光素酶实验验证其可结合AmCLC-a和AmSCAMP1启动子中的HD-ZIP结合基序，提示其可能参与调控这两个基因在盐腺中的表达。

三、关键技术方法

本研究的主要技术方法包括：①激光捕获显微切割（LCM）结合RNA-Seq，用于精确分离A. marina上表皮盐腺细胞并进行转录组测序分析，材料取自福建漳江口红树林国家级自然保护区采集的果实培育的幼苗，经0 mM和400 mM NaCl处理30天后取材；②非损伤微测技术（NMT），用于实时测定单个盐腺及转基因拟南芥根部的Na⁺和Cl^?通量；③透射电子显微镜（TEM），用于观察盐腺亚细胞结构变化；④扫描电子显微镜结合X射线能谱（SEM-EDAX）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），用于分析盐晶体成分及Na⁺/Cl^?含量；⑤异源表达功能验证，包括酵母（BY4741和AXT3K株系）、烟草叶片和拟南芥转基因体系；⑥AlphaFold3蛋白-DNA相互作用预测和双荧光素酶报告基因实验，用于验证转录因子与靶基因启动子的结合。

四、研究结果

NaCl对A. marina叶片盐分泌的影响。** 随NaCl浓度升高（0–600 mM），叶片表面盐晶体增多，400 mM NaCl处理30天时最为明显，600 mM处理下盐晶体减少。SEM-EDAX分析确认盐晶体主要由钠和氯组成。400 mM NaCl处理下Na⁺和Cl^?分泌速率均达最大值，分别为57.5 mg m^?2 day^?1和39.9 mg m^?2 day^?1。NaCl处理显著增加了叶片中Na⁺和Cl^?含量。

NaCl对盐腺Na⁺和Cl^?通量的影响。 NMT测定显示，对照植物盐腺的Na⁺和Cl^?外排维持在极低水平（约273 pmol cm^?2 s^?1和198 pmol cm^?2 s^?1），400 mM NaCl处理下达到最大值，分别为2389 pmol cm^?2 s^?1和1652 pmol cm^?2 s^?1。

盐腺的透射电子显微镜分析。 盐腺位于A. marina叶片表皮，由收集细胞、柄细胞和分泌细胞组成。盐处理植物盐腺上部完全被角质层包被，分泌细胞与角质层之间形成角质层下收集腔（subcuticular collecting cavity）。盐处理植物分泌细胞中囊泡数量增多、线粒体密度增加，柄细胞与分泌细胞之间的胞间连丝更加丰富。

LCM-RNAseq分析盐腺对NaCl处理的响应。 通过LCM成功分离完整盐腺，每个样本产生440–710万条原始读段，经质控后420–660万条读段比对到A. marina基因组。Q20和Q30值分别为91.74–93.98%和91.28–92.30%，GC含量为40.28–42.29%。

差异表达基因的GO富集分析。 共鉴定出1741个DEGs（1053个上调、688个下调）。GO富集分析显示主要富集于运输（GO: 0006810）、刺激响应（GO: 005086）、碳水化合物代谢过程（GO: 0005975）和脂质代谢过程（GO: 0006629）。运输GO项包含离子转运、跨膜运输、碳水化合物运输、水分运输、有机酸运输、胺运输和囊泡介导运输等；刺激响应GO项包含非生物胁迫响应和化学胁迫响应，特别是激素刺激、缺水胁迫和渗透胁迫；碳水化合物代谢GO项涉及纤维素代谢、β-葡聚糖代谢和多糖生物合成；脂质代谢GO项涉及角质层蜡质生物合成、木栓质生物合成和极长链脂肪酸生物合成。

参与离子转运和囊泡运输的DEGs。 23个DEGs参与离子转运，全部在盐处理样本中上调，包括18个Na⁺转运相关基因（NHX/SOS1、AKT、H⁺-ATPase及其亚基、焦磷酸驱动液泡膜质子泵PEPP、环核苷酸门控离子通道CNGC）和5个Cl^?转运相关基因（CLC、NRT1）。13个DEGs参与囊泡运输，多数上调，包括囊泡出芽相关基因（SAR1A、ALA3）、囊泡运输相关基因（3个VSR、ECHIDNA）和囊泡与细胞膜融合相关基因（SYP121、2个SYT、EXO70A1、3个SCAMP）。

参与水分和相容性溶质运输的DEGs。 14个DEGs编码水通道蛋白（aquaporins），多数上调，包括11个质膜内在蛋白（PIPs）和3个液泡膜内在蛋白（TIPs/NIP1-1）。13个DEGs参与相容性溶质运输，多数上调，包括7个脯氨酸运输相关基因（ProT1、4个AAPs、2个LHTs）和6个多元醇/糖运输相关基因（PLT4、糖转运蛋白、HEX6）。

参与激素信号传导的DEGs。 17个DEGs参与激素信号转导，主要涉及脱落酸（ABA）和乙烯（ETH）信号。ABA信号方面，ABA生物合成基因NCED1下调，ABA受体PYL4下调，而ABA降解关键酶CYP707A上调。乙烯信号方面，乙烯受体ETR1上调，7个ERF基因中6个下调，而4个RAP基因全部上调。

参与细胞壁和角质层蜡质生物合成的DEGs。 29个DEGs参与细胞壁生物合成，包括纤维素和果胶合成相关基因（CSLs、FLA17、PMEIs）以及细胞壁延展性相关基因（XTHs、Glu、EXPs），多数上调。15个DEGs参与角质层蜡质生物合成，多数在盐处理植物中下调，包括LACS、CER26、KCS、ABCG11和LTPG等。

酵母中离子转运和囊泡运输相关DEGs的功能验证。 在BY4741酵母株系中，AmNHX2、AmCLC-a和AmSCAMP1转基因酵母在500 mM NaCl处理下生长明显优于空载体对照。离子积累实验表明AmNHX2和AmCLC-a可改变盐处理下转基因酵母细胞中Na⁺和Cl^?含量。在Na⁺转运缺陷酵母（AXT3K株系）中，AmNHX2过表达酵母在15 mM NaCl条件下生长优于空载体，且Na⁺含量相应更高。

烟草叶片中亚细胞定位和离子转运基因功能验证。 AmNHX2和AmCLC-a定位于膜系统。AmNHX2和AmCLC-a过表达烟草叶片在300 mM NaCl处理下Na⁺和Cl^?含量显著改变，证实其离子转运功能。

AmSCAMP1在拟南芥中的功能验证。 150 mM NaCl处理下，AmSCAMP1过表达拟南芥株系（OE2和OE3）根长显著长于野生型（Col-0）；250 mM NaCl土壤处理下OE2和OE3鲜重更高。NMT测定显示转基因株系根部Na⁺外排增加，全株Na⁺含量低于野生型，且AtSOS1表达水平显著高于野生型。TEM观察显示150 mM NaCl处理下AmSCAMP1 OE叶片中囊泡数量最多。

盐腺特异性转录因子AmHAT2与AmCLC-a和AmSCAMP1启动子结合分析。 研究人员在A. marina基因组中鉴定出与Limonium bicolor盐腺特异性HD-ZIP转录因子LbHDZ14同源的蛋白AmHAT2（由Am23029编码）。PlantTFDB预测在AmCLC-a启动子（GGCAATCATTG）和AmSCAMP1启动子（TCCAATCATTA）中存在HD-ZIP结合基序。AlphaFold3预测显示AmHAT2 DNA结合域直接覆盖于靶基序之上，突变结合基序则破坏预测的相互作用。双荧光素酶实验证实AmHAT2可激活AmCLC-a和AmSCAMP1启动子的表达。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，A. marina盐腺在低于400 mM NaCl时泌盐速率随盐度增加而升高，超过400 mM则受抑制，与自然生境盐度范围相符。TEM观察表明盐处理增加了线粒体密度和囊泡数量，反映泌盐过程对能量和离子转运活性的高需求。与L. bicolor盐腺相比，两者分泌细胞均富含小囊泡和发达线粒体、缺乏中央液泡和叶绿体、角质层在紫外激发下呈强自发荧光，但A. marina盐腺由分泌细胞、柄细胞和收集细胞组成，且角质层在分泌细胞顶部形成角质层下收集腔以储存待分泌的盐离子。

LCM技术避免了酶解处理对RNA完整性的影响，实现了盐腺细胞的精确分离。离子转运方面，DEGs分析提示Na⁺和Cl^?分别通过SOS1和CLC从叶肉排出，再通过HKT、AKT、NRT和CNGC装载入盐腺细胞，经NHX和CLC隔离于囊泡中或通过SOS1和CLC排出，这些转运过程由质膜和液泡膜H⁺-ATPase供能。囊泡运输方面，盐处理促进囊泡出芽（SAR1A、ALA3）、从内质网到高尔基体的运输（ECHIDNA、VSRs、V-ATPase、NHXs）以及囊泡与质膜融合（EXO70A1、SYTs、SCAMPs），AmSCAMP1过表达拟南芥在盐胁迫下囊泡数量增加、Na⁺外排增强、AtSOS1表达上调，证实其在囊泡介导的泌盐和耐盐中的重要作用。水通道蛋白方面，多数PIP和TIP基因上调，参与水分排出和渗透调节。相容性溶质运输方面，脯氨酸、氨基酸和糖/多元醇转运蛋白基因上调，维持泌盐过程中的渗透平衡；盐处理下柄细胞与分泌细胞间胞间连丝增多，且编码葡聚糖内切-1,3-β-葡糖苷酶的基因上调，可能通过降解胞间连丝周围的胼胝质促进物质运输。激素信号方面，ABA生物合成和受体基因下调而降解基因上调，提示ABA水平精细调控参与泌盐；乙烯受体ETR1和部分AP2/ERF转录因子上调，表明乙烯信号通路参与泌盐过程。细胞壁方面，纤维素和果胶合成相关基因上调、细胞壁延展性相关基因（XTHs、EXPs、Glu）上调，有助于维持盐胁迫下的膨压。角质层蜡质方面，蜡质合成和转运相关基因（KCS、CER26、ABCG11、LTPG）在盐处理下显著下调，研究人员推测A. marina盐腺可能通过下调蜡质合成来增加角质层通透性，从而促进盐溶液从分泌细胞排出，这可能是A. marina特有的角质层调控泌盐机制。

研究结论：本研究通过LCM-RNAseq揭示了A. marina盐腺在盐胁迫下通过离子转运、囊泡运输、水通道蛋白介导的水分运输、相容性溶质运输、ABA和乙烯信号传导、细胞壁和角质层蜡质生物合成等多条途径协同响应盐胁迫的分子机制，并构建了盐腺通过囊泡运输进行泌盐的工作模型。AmNHX2、AmCLC-a和AmSCAMP1的功能验证为盐腺泌盐的分子机制提供了直接证据，盐腺特异性转录因子AmHAT2对AmCLC-a和AmSCAMP1的调控揭示了盐腺基因表达的转录调控机制。该研究为理解泌盐红树植物的耐盐机制提供了重要见解，对红树林保护和耐盐作物改良具有潜在的应用价值。