脂多糖跨膜运输的结构基础及其调控机制

《Nature》：Structural basis for regulating lipopolysaccharide transmembrane transport

　　

革兰氏阴性细菌被多层细胞被膜所包围，其中外层膜具有高度不可渗透性，使细菌对多种抗生素产生固有耐药性1,2,3,4,5。外层膜是一种不对称的双层膜，其内叶含有磷脂，外叶含有脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）6,7。一个称为LptB2FGCADE的脂多糖转运（Lpt）机器通过蛋白桥将LPS从内膜转运至外膜8,9。LPS的生物合成受到调控，以防止生长过程中LPS分子在内膜的有毒积累10,11,12。此前尚不清楚跨越Lpt桥的LPS转运是否也受到调控。研究人员在此展示了跨包膜Lpt复合物在无LPS、结合LPS和结合ATP三种状态下的结构，以及一个部分桥的结构。这些结构与生化实验相结合，表明Lpt桥的组装以LPS依赖的方式触发LptC跨膜螺旋（TM-LptC）的移动，从而导致ATP结合和水解增加。研究人员还证明，体内LPS转运需要桥的形成和TM-LptC的移动。研究数据支持一个模型，即组装的Lpt桥响应内膜中LPS的存在，通过移动TM-LptC来开启转运，从而将LPS转运活性与桥组装及内膜LPS的存在相协调。

论文解读：脂多糖跨膜运输的结构基础与调控机制

一、研究背景与问题

革兰氏阴性细菌的细胞被膜由内膜（inner membrane，IM）、肽聚糖细胞壁和外膜（outer membrane，OM）构成。外膜是不对称的双层膜，内叶含磷脂，外叶含脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），这一LPS层能有效排斥多种对革兰氏阳性菌有效的抗生素，导致治疗革兰氏阴性菌感染的策略极为有限。LPS在内膜合成后，必须跨越水性周质空间并穿过外膜到达细胞表面。这一过程由LPS转运（Lpt）机器完成：内膜ABC转运复合物LptB2FGC、外膜转位子LptDE以及可溶性周质蛋白LptA共同组装形成连续的跨包膜蛋白桥LptB2FGCADE，利用细胞质中ATP结合和水解的能量，将LPS从内膜提取并逆浓度梯度直接转运至外膜外叶。

已有研究指出，控制LPS水平的途径之一是关闭LPS生物合成。然而，LPS转运速率是否受到调控此前尚不清楚。LPS转运速率取决于桥的数量及其是否处于活性状态。细胞中可观察到两种寿命不同的LptB2FGCADE桥，研究人员曾提出只有寿命较长的桥能主动转运LPS；降低LPS水平会减少组装桥的比例，提示桥组装依赖LPS，但活性桥形成的分子机制一直未知。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了组装型Lpt桥的三种不同结构，分别为无LPS状态、LPS结合状态和ATP结合状态，同时获得了一个部分桥的结构。这些结构结合生化实验，揭示了控制活性Lpt桥形成的分子机制。研究表明，Lpt桥组装以LPS依赖的方式触发LptC跨膜螺旋（TM-LptC）移动，进而增加ATP结合和水解；体内LPS转运需要桥的形成和TM-LptC的移动。数据支持一个调控模型：组装的Lpt桥感知内膜中LPS的存在，通过移动TM-LptC开启转运，从而将LPS转运活性与桥组装和内膜LPS丰度协调起来。该研究发表于《Nature》。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：利用位点特异性光交联氨基酸p-苯甲酰-L-苯丙氨酸（pBPA）引入LptD和LptC/LptA融合蛋白中，实现LptB2FGCADE桥的体外稳定与纯化；采用冷冻电镜单颗粒分析技术，结合局部细化（local refinement）获得Lpt桥不同区域的高分辨率密度图并构建复合密度图；运用闪烁邻近分析（scintillation proximity assay，SPA）测量不同Lpt复合物对ATP的平衡结合亲和力；使用基于蛋白酶脂质体的ATP水解实验测定桥组装前后及有无LPS时的ATPase活性；通过体内光交联与免疫印迹检测LPS与Lpt组分的交联，评估转运活性。样本来源为大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统，LptDE等蛋白来自E. coli，LptB(E163Q)2FGCADE等突变体也利用E. coli菌株制备。

四、研究结果

1. 组装Lpt桥的稳定化

研究人员首先尝试直接从细胞中分离完整的Lpt桥，但组装桥在纯化过程中解离。为此，他们采用LptC–LptA融合蛋白（由柔性聚甘氨酸-丝氨酸接头连接）构建部分桥，并通过在LptD的Y63位引入pBPA，与LptA形成高效光交联，从而稳定全长LptB2FGCADE桥，成功用于冷冻电镜结构解析。

2. LptB2FGCADE桥的结构

解析的跨包膜Lpt复合物呈细长结构，长度约280 ?。LptFG跨膜螺旋形成的腔室内有清晰的LPS密度。周质结构域由LptF、LptC、LptA和LptD的β-jellyroll结构域构成一个略微旋转的螺旋槽，槽内表面主要含疏水残基，适合容纳LPS酰基链。但槽内存在若干收缩点，空间不足以让LPS通过，提示周质结构域需要构象柔性才能完成转运。在LPS结合的全桥中，LptFG跨膜螺旋采取更接近LptB2FG的构象，而TM-LptC没有有序密度，说明在组装桥背景下TM-LptC可在核苷酸结合前移动。

3. 无LPS的Lpt桥结构

为获得LPS位于周质部分的桥结构，研究人员在LptC T47位引入pBPA，并对细胞进行紫外照射后再纯化桥。虽然无法直接观察交联的LPS，但该结构中LptFG腔内无LPS密度，而TM-LptC有序，且其构象与LptB2FGC类似。与LPS结合桥对比可知，LPS结合导致LptFG跨膜螺旋构象改变，伴随TM-LptC的离域。于是将两种状态分别称为LPS结合态和LPS游离态。

4. TM-LptC在桥与LPS结合时移动

研究人员解析了LPS结合的LptB2FGCA结构（3.1 ?），发现其腔内既有LPS，TM-LptC也有序。对比LPS结合的LptB2FGCA、LPS结合的全桥和LPS游离全桥的跨膜区构象，发现全桥中LptG的TM1–TM3螺旋向LPS收缩，形成稳定相互作用，从而将TM-LptC挤出其结合位点。这种构象变化仅在全桥中出现，且未添加核苷酸，说明TM-LptC的移动可在组装并装载LPS的桥中独立于核苷酸结合发生。

5. TM-LptC调节ATP结合亲和力

通过SPA测量，催化失活突变体LptB(E163Q)2FG的ATP结合亲和力（Kd≈20 μM）高于LptB(E163Q)2FGC（Kd≈40 μM），单独添加LPS不改变二者的亲和力。部分桥LptB(E163Q)2FGCA无论有无LPS，其Kd均接近LptB(E163Q)2FGC；而全桥LptB(E163Q)2FGCADE在加入LPS后Kd变为≈20 μM，无LPS时则为≈40 μM。这表明全桥中LPS的存在通过位移TM-LptC提高了ATP结合亲和力。

6. ATP结合的全桥结构

对ATP结合的LptB(E163Q)2FGCADE进行cryo-EM分析，其内膜区域结构显示LptB形成闭合二聚体，LptFG跨膜螺旋重排使腔室收缩，TM-LptC无密度。这说明组装桥在催化循环中同样经历与部分桥一致的核苷酸结合中间态。ATP结合是否需先移动TM-LptC，取决于桥是否已结合LPS。

7. LPS结合的Lpt桥具有最高ATPase活性

在无LPS的LptB2FGCA蛋白酶脂质体中，加入LptDE蛋白酶脂质体不改变ATPase活性；而在含LPS的LptB2FGCA蛋白酶脂质体中，ATPase活性随LptDE加入显著升高。表明只有组装成跨包膜桥且结合LPS时，转运活性才被底物激活。

8. TM-LptC在体内移动是LPS转运所必需的

引入LptA(A152R)突变阻止LptA与LptD结合，从而阻断桥组装。体内光交联显示，在桥组装受阻时LptG与TM-LptC的交联增加，说明TM-LptC的离域依赖桥组装。在LptA L116位引入pBPA检测LPS交联：野生型复合物无论有无TM-LptC均能交联LPS；但桥组装受阻时，只有缺失TM-LptC才能交联LPS，说明TM-LptC移动是体内LPS转运的前提。

9. LptC(ΔTM)拯救外膜转位子缺陷

LptE(K136D)突变降低LptDE对LPS的结合亲和力，导致外膜通透性增加且转运减少。研究人员发现删除TM-LptC可恢复LptE(K136D)菌株在MacConkey琼脂上的生长。LptE(K136D)不影响桥组装，但增加TM-LptC与LptG的交联，表明TM-LptC更倾向于停留于近端位置；该背景下LPS到LptA的交联减少，而缺失TM-LptC则恢复LPS转运。这说明TM-LptC还能响应外膜转位子的状态来调节转运活性。

10. 桥可同时结合多个LPS分子

为检验LPS转运的“PEZ”模型，研究人员在同一个LptCA融合蛋白的LptC T47和LptA L116两个位点同时引入pBPA，并在体外和体内进行光交联。结果显示LptCA可同时交联两个LPS分子，且随时间推移LptC和LptA上的交联比例接近相等，符合PEZ模型预测，说明体内LPS转运确实通过多个LPS分子依次推进的方式提高通量。

五、讨论总结

外膜生物发生要求每个分裂周期将数百万个LPS分子运至细胞表面，而LPS在内膜外叶或外膜内叶的错误定位均有毒性。研究人员提出一个协调模型：LPS转运机器感应内膜或外膜处的LPS水平，通过移动TM-LptC上调或下调转运活性。当组装桥结合LPS时，LptFG跨膜螺旋收缩并接触LPS，使TM-LptC移位，进入“预激活”（primed）状态，ATP结合亲和力和水解活性增加，从而加速转运；若LPS缺乏或外膜转位子无法有效插入LPS，TM-LptC回到原位，转运减速。该调节与LpxC降解介导的LPS合成抑制机制互补，构成稳态调控网络。针对Lpt机器的药物zosurabalpin（处于III期临床开发）结合LPS在LptB2FG中的位点与TM-LptC定位时的位置重叠，提示其特异性靶向TM-LptC已解离的活性状态，这解释了该药物的效力。本研究的结构为理解Lpt桥如何调控LPS转运以及设计靶向该过程的抑制剂提供了路线图。