《Nature》：Alveolar stem cells transdifferentiate to drive bronchiolar regeneration
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肺由两个解剖学上截然不同的区室构成：气道与肺泡。尽管已知气道上皮干细胞可动员参与肺泡再生，但肺泡细胞能否反向跨越这些解剖边界并参与支气管修复仍不清楚。研究人员开发了小鼠双重组酶介导的谱系示踪技术，证明肺泡Ⅱ型（AT2）细胞可迁移至受损细支气管并转分化为club
肺由两个解剖学上截然不同的区室构成：气道与肺泡。尽管已知气道上皮干细胞可动员参与肺泡再生，但肺泡细胞能否反向跨越这些解剖边界并参与支气管修复仍不清楚。研究人员开发了小鼠双重组酶介导的谱系示踪技术，证明肺泡Ⅱ型（AT2）细胞可迁移至受损细支气管并转分化为club细胞和纤毛细胞，从而主动参与气道再生。机制上，支气管损伤后，浸润的免疫细胞分泌SPP1，建立趋化梯度引导细胞迁移。支气管周围AT2细胞通过整合素ITGB1感知该SPP1信号并向受损细支气管迁移。到达后，这些迁移的AT2细胞接收来自驻留纤毛细胞的Notch配体，导致Notch通路激活，进而驱动其向club细胞转分化。该转分化过程伴随以Cldn4表达为标志的中间阶段。功能阻断SPP1或ITGB1可损害AT2细胞迁移，而抑制Notch信号则可阻止其向club细胞转分化。综上，研究结果揭示了一种支气管上皮修复的跨区室细胞机制，拓展了当前对肺再生可塑性的理解，并可能为气道损伤的治疗策略提供参考。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
慢性及急性肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺炎和支气管扩张）均涉及支气管上皮损伤，损害气道再生能力并加速疾病进展。肺上皮由气管、细支气管和肺泡三个不同区室构成，各区室拥有维持稳态和修复的特化祖细胞：气管中以基底细胞为多能干细胞；细支气管中club细胞和神经内分泌（NE）细胞驱动局部再生；肺泡区室依赖肺泡Ⅱ型（AT2）细胞自我更新并分化为AT1细胞以维持气体交换。位于细支气管-肺泡导管连接处（BADJ）的支气管肺泡干细胞（BASCs）共表达Scgb1a1和Sftpc，具有跨细支气管和肺泡区室的多能性。近年研究已揭示club细胞在肺泡修复中的可塑性，但肺泡细胞反向参与细支气管再生的能力尚不清楚。体外研究提示人AT2细胞可分化为气道基底细胞和细支气管分泌细胞，非人灵长类损伤模型中也观察到类似现象，但遗传操作局限性阻碍了体内决定性证据的获取。在传统小鼠模型中，Sftpc-creER谱系示踪因AT2细胞和BASCs均表达Sftpc而无法精确追踪AT2细胞命运，导致结果解读混淆。因此，亟需建立AT2细胞特异性遗传标记工具，以明确肺泡细胞是否在体内参与细支气管再生。
二、研究内容与主要结论
该研究发表于《Nature》，建立了一套AT2细胞特异性体内标记系统，采用双基因标记介导的谱系示踪策略，在细支气管损伤模型中证实AT2细胞可跨越解剖边界迁移并转分化为功能性club细胞和纤毛细胞，参与跨区室上皮修复。机制上，该过程依赖整合素β1介导的迁移和Notch依赖的命运决定：支气管损伤后，浸润免疫细胞分泌SPP1引导AT2细胞向受损细支气管迁移，残存纤毛细胞激活Notch信号驱动AT2向club细胞转分化。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术：双重组酶介导的遗传谱系示踪系统（包括Sftpc-creER与Scgb1a1-DTR-GFP组合的AT2-tracer1、Scgb1a1-creER;Sftpc-dreER与R26-NR嵌套报告系统组合的AT2-tracer2、R26-TLR三色谱系示踪系统区分club细胞、AT2细胞和BASCs、Cldn4-LSL-dre与Lamp3-creER组合追踪CLDN4?中间态细胞）；单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞ATAC测序（scATAC-seq）多组学分析；伪时间轨迹分析；CellChat细胞间通讯推断；条件性基因敲除与过表达（Rbpj、Notch2、Jag1、Cldn4基因敲除及R26-NICD过表达）；白喉毒素（DT）介导的细胞消融模型与萘损伤模型；SPP1功能阻断实验。样本来源于基因工程小鼠模型，未涉及人类临床样本队列。
四、研究结果
AT2细胞再生气道上皮
研究人员首先利用AT2-tracer1系统（Sftpc-creER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP）在白喉毒素诱导的细支气管损伤模型中追踪AT2细胞命运。DT选择性清除GFP?细胞群后，4周恢复期可见tdT标记的AT2细胞迁移至细支气管并生成tdT?GFP?club细胞。定量分析显示77.42±4.71%的新生club细胞来源于AT2细胞。AT2来源的细支气管细胞中，club细胞占38.18±4.55%，未分化AT2细胞占14.61±2.62%，AT1细胞占18.90±4.48%，纤毛细胞占0.27±0.07%。研究还鉴定出两条迁移路径：经BADJ（路径1）和经支气管壁通道（路径2），其中路径1为主要贡献途径。单细胞水平Confetti谱系示踪证实单个AT2细胞具有多向转分化能力。
基底细胞和NE细胞的区域性气道再生
利用p63-dreER;R26-RSR-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP小鼠追踪基底细胞命运，发现气管中几乎所有再生的club细胞均来源于基底细胞，而远端细支气管中罕见的基底细胞仅贡献少量club细胞，表明基底细胞主要再生近端气道。此外，细支气管中检测到SCGB3A2?SCGB1A1?小叶内浆液（IS）细胞，DT损伤后增殖。利用Ascl1-creER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP追踪NE细胞，发现NE细胞贡献4.59±1.36%的远端club细胞。综上，club细胞再生具有区室特异性，主要由AT2细胞和基底细胞驱动，NE细胞或IS细胞贡献较小。
AT2细胞贡献club细胞再生
为在生理条件下研究AT2介导的再生，研究人员使用萘损伤模型并采用双重组酶系统。AT2-tracer2（Scgb1a1-creER;Sftpc-dreER;R26-NR）结果显示4周时42.93±5.60%的再生club细胞为ZsG?，AT2来源的细支气管细胞中club细胞占62.31±4.98%。单细胞多组学分析表明AT2来源的club细胞在转录和表观遗传水平上与天然气道细胞趋同，AT2特异性表观遗传特征在转分化后迅速下降，而club细胞特异性和分泌/免疫特征随时间增加。利用R26-TLR三色系统在同一小鼠中区分club-tracer、AT2-tracer3和BASC-tracer，4周时AT2-tracer3贡献52.35±7.09%的再生club细胞，BASC-tracer贡献26.66±6.15%，club-tracer贡献14.89±3.72%，确立AT2细胞为远端细支气管上皮修复的主要细胞来源。
CLDN4?中间态介导AT2向club细胞转变
scRNA-seq分析AT2-tracer3细胞揭示五个细胞簇：成熟AT2、瞬时态、club样、pre-AT1和AT1。伪时间分析显示AT2来源分化路径经CLDN4?中间态分叉至club细胞或pre-AT1至AT1，证实双潜能性。瞬时态细胞富集伤口反应、凋亡和迁移相关通路，club细胞富集外源物代谢、炎症和Notch信号通路。利用Lamp3-creER;Scgb1a1-DTR-GFP;Cldn4-LSL-dre;R26-RSR-LSL-tdT系统追踪CLDN4?瞬时细胞，证实其贡献62.10±6.16%的新生club细胞。条件性Cldn4敲除显著降低AT2向club细胞（65.94±6.50%降至25.49±3.54%）和AT1细胞（21.11±2.74%降至8.82±1.56%）的转分化效率，表明CLDN4?中间态功能性促进AT2介导的上皮修复。
Notch信号调控AT2向club细胞转化
研究人员在Scgb1a1-creER;Sftpc-dreER;R26-TLR;Rbpjrox/rox小鼠中条件性敲除Rbpj，发现Rbpj缺失的AT2细胞虽能迁移至细支气管但不表达club细胞标记，反而保留肺泡标记。AT2-tracer3来源的club细胞比例从对照的38.09±5.29%降至1.86±0.80%，BASC-tracer来源的club细胞从25.97±4.97%降至6.48±2.08%。DT损伤模型中Rbpj敲除同样显著减少club细胞形成（3.95±1.83%对31.54±7.39%），而Notch过表达（R26-NICD）增强AT2向club细胞转化（45.19±4.69%）并抑制肺泡命运。功能上，Rbpj敲除增加支气管壁厚度并减少小气道通气，表明Notch介导的club细胞再生对结构和功能恢复至关重要。
纤毛细胞通过Notch配体介导AT2向club细胞转化
scRNA-seq分析显示损伤后纤毛细胞是主要的Notch配体来源（高表达JAG1/2），CellChat交互分析确认纤毛细胞与AT2来源细胞间存在JAG1/2-Notch1/2信号。利用Foxj1-creER;R26-iDTR选择性消融纤毛细胞后，AT2向club细胞转化率从25.71±4.87%降至3.84±2.25%。空间分析显示成功转化的AT2来源club细胞主要定位于纤毛细胞邻近区域。条件性敲除纤毛细胞中的Jag1显著减少AT2来源的club细胞，敲除AT2来源细胞中的Notch2同样抑制AT2向club细胞转变，证实纤毛细胞通过JAG1-NOTCH2信号轴调控AT2向club细胞转分化。
SPP1通过整合素β1诱导AT2迁移
scRNA-seq分析DT损伤肺组织，发现损伤诱导中性粒细胞浸润和支气管周围成纤维细胞扩增。CellChat分析显示损伤后中性粒细胞、单核细胞和支气管周围成纤维细胞成为向AT2细胞的主要信号来源，其中SPP1信号被强烈诱导。DT损伤显著增强免疫来源SPP1与AT2细胞上整合素异二聚体的相互作用，与迁移和S期基因特征上调相关。空间转录组分析显示白细胞活化/趋化模块富集于管腔和支气管周围区域。免疫荧光证实CD45?SPP1high细胞浸润。SPP1抑制剂处理显著减少AT2细胞在远端细支气管的覆盖。条件性敲除AT2细胞中的Itgb1同样降低AT2细胞在细支气管的覆盖及club细胞转化效率，证实SPP1-ITGB1轴驱动AT2细胞向受损细支气管的趋化迁移。
五、讨论与结论
该研究通过双重组酶谱系示踪技术提供了AT2细胞跨区室参与细支气管修复的决定性体内证据，填补了肺泡细胞反向参与气道再生研究的空白。研究发现AT2细胞是远端细支气管上皮修复的主要细胞来源，贡献超过半数的新生club细胞，其贡献超过BASCs和club细胞自身。机制上，损伤后免疫细胞分泌SPP1建立趋化梯度，AT2细胞通过整合素ITGB1感知信号并迁移至受损细支气管；到达后，残存纤毛细胞通过JAG1-NOTCH2激活Notch信号，驱动AT2经CLDN4?中间态转分化为club细胞。该过程受Notch信号双向调控：Notch缺失使AT2细胞滞留肺泡命运并导致细支气管中肺泡细胞异常积累，Notch过表达则促进club细胞命运。研究还揭示了AT2来源club细胞在转录和表观遗传水平随时间与天然club细胞趋同，最终获得成熟功能特征。这些发现拓展了肺再生可塑性的认知框架，揭示了跨区室细胞协作修复的普遍原理，为气道损伤相关疾病（如COPD、哮喘、支气管扩张）的再生治疗策略提供了潜在分子靶点。
