多构型厌氧氨氧化系统中微生物群落分化与机器学习驱动的脱氮优化

《Journal of Environmental Management》：Microbial community differentiation and machine learning–driven optimization of nitrogen removal in multi-configured anammox systems

　　

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  IFAS生物膜中蕴藏着高度多样且拓扑结构复杂的微生物组。
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  微生物网络区分了悬浮态与附着态的微生物群落。
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  LightGBM模型在反应器类型分类及关键厌氧氨氧化生物标志物识别中表现最佳。
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  实验室数据显示悬浮污泥（SS）与生物膜（BF）中微生物分类单元和功能基因存在差异。

引言

厌氧氨氧化（Anammox）是一种成熟的生物脱氮技术，在过去二十年中吸引了污水处理领域的广泛关注。在该过程中，厌氧氨氧化细菌（AnAOB）在缺氧条件下直接将铵氮和亚硝酸盐转化为氮气（Strous et al., 1999; Jetten et al., 1999），相较于传统的硝化-反硝化路径具有显著优势，包括大幅降低的能耗需求（Silva and Rosa, 2015）以及无需补充外源有机碳（Kartal et al., 2013; van Niftrik and Jetten, 2012）。厌氧氨氧化已成功应用于多种系统，包括市政污水处理厂、工业废水以及富含铵氮的废液（Lackner et al., 2014）。研究表明，厌氧氨氧化菌群在不同生物工艺构型下表现出不同的群落结构和功能特征，这些差异与运行条件、生物载体形态和环境因素密切相关（Gonzalez-Martinez et al., 2015; Vlaeminck et al., 2010）。一体化固定膜活性污泥（IFAS）反应器在单一容器内结合悬浮态与生物膜生长生态位，已成为促进厌氧氨氧化富集和提升工艺稳定性的有前景的混合构型（Stewart and Franklin, 2008）。该双相结构理论上创造了不同的微环境，促进了悬浮相与附着相之间的代谢耦合（Stewart and Franklin, 2008），并且其脱氮性能可能与单相系统有所不同（Topcuoglu et al., 2020）。

尽管文献中关于厌氧氨氧化相关群落的分类组成特征已得到日益细致的表征（Hu et al., 2012; Kartal et al., 2012），但关于不同生长形态间功能差异以及关键功能微生物识别等根本性问题仍然存在。因此，目前对厌氧氨氧化微生物群落如何在不同反应器构型中组织和运作的理解仍不完整（Saunders et al., 2016; Vanwonterghem et al., 2014）。然而，验证这一理论优势的经验基础尚不充分，更关键的是，微生物表征在实际运行中用于实时指导的实用性尚未得到确立。在实践中，大多数厌氧氨氧化污水处理厂运行IFAS反应器时缺乏分子层面的定量运行指导。当前的工艺控制主要依赖宏观参数和反应器性能指标，而这些反馈仅在性能已经下降后才提供。

相比之下，通过DNA测序揭示的微生物群落组成提供了群落组成和遗传潜力的累积特征谱。仅凭16S rRNA基因的相对丰度无法建立代谢活性或生理状态，尽管群落变化可能与运行胁迫有关（Marcos-Zambrano et al., 2021）。如果能够识别出可靠的微生物生物标志物，从而准确预测反应器状态、群落稳定性和脱氮能力，操作人员将有机会更早地检测预警信号并主动实施纠正措施，而非被动等待处理性能失效。因此，系统地表征悬浮污泥（SS）、纯生物膜以及IFAS系统中两个相态内的微生物群落结构、互作模式和功能能力，对于揭示是否存在此类生物标志物以及能否在不同运行场景中可靠应用至关重要（Park et al., 2015）。以往厌氧氨氧化微生物组研究通常仅考察悬浮污泥或生物膜系统，限制了对不同构型在各自运行条件下的比较分析（Gonzalez-Gil et al., 2015; Park et al., 2015）。当研究IFAS反应器时，以往工作很少同时表征所有四个区室，即悬浮污泥（SS）、纯生物膜（BF）、IFAS悬浮相和IFAS生物膜。这种全面视角至关重要，因为IFAS的双相结构从根本上重塑了微生物群落，与单相系统形成鲜明对比（Zhou et al., 2024）。

此外，以往的IFAS研究缺乏共现网络拓扑分析与机器学习框架的整合，该框架能够区分具有真正判别力的分类单元与仅丰度较高但无判别价值的分类单元（Yang et al., 2023）。这一区分至关重要，因为高丰度与诊断价值并不等同。而且，通过回顾性数据挖掘识别的生物标志物很少在受控实验室条件下进行验证，而实验室条件中的变量运行历史可能造成干扰（Zhou and Ning, 2017）。目前该领域缺乏一个整合网络分析、带可解释性度量的机器学习以及实验验证的综合框架，以超越描述性表征，迈向可用于实时工艺监测的可操作生物标志物。

为应对上述科学问题，本研究基于从IFAS反应器、SS系统和纯生物膜系统收集的472组样本进行了回顾性分析，并结合受控实验室对比实验。对四类微栖息地样本进行了多样性和物种共现网络分析，展示了四类样本在社区结构和推断的互作模式上的差异。基于LightGBM机器学习分类模型结合SHAP可解释性分析，筛选出了对实际运行条件具有可靠判别能力的微生物分类单元，既识别了与样本类别分化相关的分类单元，又将判别贡献与单纯丰度区分开来。筛选出的分类单元在稳定运行的实验室IFAS反应器中进行了进一步验证，观测到的群落模式在实测验证样本中得以重现。此外，从稳定运行的实验室IFAS反应器中采集SS和生物膜微生物样本进行16S rRNA高通量测序和宏基因组测序。结果显示，IFAS的生物膜相中厌氧氨氧化细菌和氮循环基因的相对丰度高于悬浮活性污泥相，表征了两个相态差异所关联的遗传潜力。最后，本研究将反应器脱氮性能与微生物特征谱进行对比，评估了关键分类单元与实测IFAS反应器条件之间的关联，为未来的运行研究提供了依据。我们将反应器构型作为监督标签以识别IFAS特异的微生物生物标志物，这些标志物可应用于快速监测工具，包括qPCR、FISH和综合水质模型。

章节摘要

反应器运行条件与采样

采用一台2 L透明丙烯酸IFAS反应器进行连续流实验验证。以60 mL/min通入氮气以维持DO < 0.1 mg/L。温度控制在30 ± 1 °C，pH用NaHCO₃维持在8.0–8.5。反应器进水为含NH₄Cl和NaNO₂为主要底物的合成厌氧氨氧化废水，氮负荷率约为0.65 kg N·m^?3·d^?1，水力停留时间（HRT）为12 h。运行50

不同反应器构型间细菌群落的差异

将四类样本（SS、BF、IFAS(SS)和IFAS(BF)）所获16S rRNA序列以97%序列相似性聚为OTU，并对照SILVA v138进行分类注释，共获得79门和1594属，超过78.82%的序列可分类至属水平。多样性分析揭示，IFAS组在该数据集中表现出更高的多样性指标和独特的群落谱，相对于独立运行组。IFAS(SS)的Shannon指数和

结论

本研究结合472组样本的回顾性分析与实验室验证，表征了SS、BF、IFAS(SS)和IFAS(BF)厌氧氨氧化系统间的微生物分化。IFAS的悬浮相和附着相表现出不同的微生物群落和关联网络结构。生物膜相与厌氧氨氧化细菌及相关功能潜力更为密切关联，而悬浮相则表现出不同的微生物和功能特征。LightGBM

CRediT作者贡献声明

石欣然：撰写初稿、可视化、正式分析、数据整理。孙佳琪：软件、数据整理。周世杰：撰写审阅与编辑、可视化。张天旭：撰写审阅与编辑、指导、概念设计。曾庆友：调查研究。刘伟：方法论。孙彬彬：资源提供、数据整理。朱伟迪：验证、正式分析。曾明：资源提供、项目管理、经费获取、数据整理。

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究获得了国家自然科学基金（22276135、42507374、42207435）和河北省自然科学基金（编号：B2023202077）的资助。

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