霍山石斛通过调控m6A甲基化修饰及NRF2-GPX4/TLR4-MyD88信号通路改善大鼠生精功能障碍

《Journal of Ethnopharmacology》：Dendrobium huoshanense ameliorates spermatogenesis disorder in rats through modulating m6A methylation modification and the NRF2-GPX4/TLR4-MyD88 signaling pathways

霍山石斛对SPD模型大鼠睾丸损伤具有显著改善作用。•DH通过调节生殖细胞的m6A甲基化修饰改善SPD。•DH通过影响生殖细胞中NRF2-GPX4/TLR4-MyD88信号通路改善SPD。•DH中的主要化学成分集中于黄酮类和双苄类化合物。

引言

生精障碍（SPD）是男性不育最常见的形式，约占所有男性不育病例的40%~60%。世界卫生组织报告显示，全球约8%~12%的育龄夫妇经历不孕不育，其中男性因素约占近50%，SPD是其核心的病理亚型（Agarwal等，2021；Sharma等，2021）。在过去半个世纪中，全球精子浓度和总精子计数呈显著下降趋势，这一现象在工业化国家尤为明显，现已被视为全球公共卫生危机（Levine等，2023；Lv等，2021）。SPD的病理机制极为复杂，涉及多因素协同作用：遗传因素（Y染色体微缺失、染色体非整倍体）；内分泌紊乱（下丘脑-垂体-性腺轴功能障碍、雄激素受体缺陷）；生殖道感染和炎症（附睾炎、前列腺炎、精索静脉曲张）；氧化应激（活性氧过度产生和抗氧化防御受损）；环境和生活习惯因素（塑化剂、重金属、农药残留、吸烟、酗酒、肥胖、热暴露）。目前临床一线治疗主要包括促性腺激素替代疗法（适用于低促性腺激素性性腺功能减退）、芳香化酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂、抗氧化补充剂（如维生素E、维生素C、辅酶Q10、锌和硒制剂）以及辅助生殖技术（ICSI）。然而，这些方法存在明显局限性：激素疗法适应症狭窄且副作用较大（Eisenberg等，2023）。抗氧化疗法的临床试验结果相互矛盾，缺乏一致的疗效证据；虽然ICSI可以解决受精问题，但无法改善精子内在质量，且后代遗传风险仍不确定。因此，从天然产物中寻找高效、低毒、多靶点保护生精功能的活性成分已成为突破男性不育治疗瓶颈的重要方向。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang & S. J. Cheng），又称"米斛"，是兰科多年生附生草本植物。主要分布于安徽省霍山县及周边大别山地区。由于其生长缓慢、资源稀少且药用功效显著，被誉为"中国九大仙草之首"，地位高于铁皮石斛（Gao等，2022）。《神农本草经》首次记载该药材能"补五脏虚劳羸瘦，强阴"。其中"强阴"指其能壮肾阴、补肾精。《名医别录》进一步阐述其能"益精，补内虚不足，治脚膝中痛冷弱"，明确指出其具有补肾精的功效。《药性论》则更直接地指出其"主男子腰膝软弱，强阴，治冷劳羸损，补肾益精，滋养肾气，固本扶正"，进一步证实其补肾益精以及强阳解痿的功效。在中医男科临床实践中，DH常与枸杞子、菟丝子、淫羊藿等补肾填精药物配伍，用于治疗肾精亏虚型（或肾阴虚型）少弱精症（Li等，2026；Zhu等，2024）。现代植化研究表明，DH富含多糖、双苄、菲、黄酮、酚酸以及多种氨基酸和微量元素（Lin等，2025）。在石斛属中，铁皮石斛和蝴蝶兰均已被报道能改善SPD。多项独立研究探讨了石斛多糖对SPD的保护作用。Lei等证明，蝴蝶兰多糖通过增强生精细胞增殖、抑制凋亡和上调SIRT1表达来缓解糖尿病引起的睾丸损伤（Lei等，2022）。同样，Luo等报道，来源于蝴蝶兰的多糖通过抑制凋亡和激活睾丸内糖酵解通路来保护糖尿病小鼠免受SPD（Luo等，2022）。此外，Mu等揭示，铁皮石斛多糖通过降低氧化应激水平、改善睾丸激素微环境以及调节Sertoli细胞和生精细胞中特定基因的表达来减轻氧化应激介导的损伤（Mu等，2023）。然而，DH改善SPD的药理学效果和潜在机制——特别是涉及m6A RNA甲基化修饰的机制——尚未有系统的报道。

m6A修饰已被越来越多的研究证实广泛参与雄性生精过程。Xiong等的研究进一步揭示，父系多代肥胖通过增加METTL3介导的Wt1 N6-甲基腺苷修饰来增强后代生精障碍的易感性（Xiong等，2024）。Naderi的综述研究也指出，分析精子DNA中5mC/5hmC水平以及m6A-RNA甲基化调节因子可揭示生精缺陷并预测生育结局（Naderi等，2025）。Tan的研究也表明，N6-甲基腺苷（m6A）及其阅读器蛋白YTHDC1、YTHDC2、YTHDF2和PRRC2A在生精和减数分裂过程中发挥关键作用（Tan等，2023）。同时已证实NRF2-GPX4/TLR4-MyD88通路参与SPD的病理过程。Lai的研究证明，白藜芦醇（一种源自DH的活性双苄化合物）通过纠正脂质和谷胱甘肽代谢紊乱、减轻氧化应激以及激活NRF2/GPX4信号通路，有效缓解高脂饮食诱导的睾丸损伤（Lai等，2026）。同样，Wang等的研究指出，在外源化合物刺激下，肠道来源的脂多糖（LPS）可能经循环系统迁移至睾丸，从而上调睾丸组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体的表达水平，最终导致睾丸炎症（Wang等，2023）。与此同时，DH中的双苄成分，如白藜芦醇和dendrocandin U，已被证明在改善氧化应激和炎症反应方面具有显著效果（Piao等，2023；Shahcheraghi等，2023）。先前的研究已证实m6A修饰通过影响mRNA稳定性来调控NRF2-GPX4/TLR4-MyD88信号通路的活性。Liu等报道，HNRNPC稳定m6A修饰的AC145207.5，从而抑制Nrf2/GPX4轴介导的铁死亡并加速结肠癌肿瘤发生（Liu等，2025）。Yang等证明，EF24特异性下调m6A甲基转移酶METTL3的表达，导致NRF2 mRNA失稳并阻碍其蛋白翻译，最终导致GPX4耗竭并触发铁死亡级联反应（Yang等，2025）。Luo等证明，TLR4 mRNA发生m6A修饰，该修饰同时增强其翻译效率并延缓其降解，从而上调TLR4蛋白表达并最终促进中性粒细胞中TLR4信号通路的激活（Luo等，2023）。

基于上述背景，本研究旨在探讨DH提取物在雷公藤糖苷（TWG）诱导的大鼠SPD模型中的药效学评价和潜在机制。SPD模型通过连续30天灌胃给予TWG建立。大鼠分为以下组别：空白对照组、模型组、低、中、高剂量DH组和阳性药物（L-肉碱）组。采用H&E和Masson染色评估睾丸组织病理学改变和纤维化。对METTL3、METTL14、METTL16、WTAP和ALKBH5进行免疫荧光和Western blot分析以评估DH对RNA甲基转移酶的影响。同样，对TLR4、MyD88、NRF2和GPX4进行免疫荧光和Western blot分析以评估DH对睾丸氧化应激和炎症状态的影响。采用MeRIP-seq检测DH对睾丸组织全转录组水平m6A修饰的影响。对睾丸组织进行代谢组学和转录组学分析以评估DH对甲基供体（肉碱衍生物）丰度的影响，并阐明DH在转录水平上如何调控RNA甲基转移酶基因的表达。此外，采用UPLC-TripleTOF 5600根据精确的前体离子质量（<5 ppm误差）和MS/MS碎裂图谱鉴定DH水提物中主要活性成分的结构类型。本研究旨在系统阐明珍稀药用植物DH改善SPD的药效物质基础和作用机制，从而为开发靶向m6A表观转录组调控睾丸微环境和氧化应激干预的新型男性不育治疗药物提供坚实的科学基础和先导化合物资源。

实验动物和化学试剂

药材样品经鉴定为DH干燥茎，系兰科石斛属的一种植物，由西华大学董刘教授鉴定。凭证标本（标本编号：2025DH0009）保存于中国安徽省六安市西华大学生命健康学院。乙腈和甲醇（色谱级纯度）均购自美国赛默飞世尔科技公司。METTL3（GB154688-100）、METTL14（GB150106-100）、METTL16（GB114475-100）。

DH水提物在SPD大鼠模型中显著改善睾丸组织病理学损伤并逆转血清性激素水平波动

各组大鼠睾丸组织H&E和Masson染色分析及血清性激素水平检测结果如图1所示。如图所显示，空白对照组大鼠睾丸各级生精细胞排列整齐完整，生精小管充盈饱满。模型组大鼠大量生精细胞脱落，残余的生精细胞和Sertoli细胞排列紊乱。

分析与讨论

由于获批的药物治疗手段有限、激素疗法的副作用较大以及辅助生殖技术的伦理问题，SPD的管理仍然是临床难题（Grande等，2024；Mazzilli等，2023）。因此，迫切需要从天然产物中识别安全有效的替代治疗药物。本研究显示DH作为一种珍稀名贵中药……

结论

传统珍稀名贵中药材DH通过上调RNA甲基转移酶METTL3/METTL14蛋白复合物来改善SPD，从而增加睾丸生精细胞中肉碱相关物质（甜菜碱、L-肉碱及其他肉碱衍生物）的消耗，导致m6A修饰增强以及SRY-box转录因子9（Sox9）、谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）和核因子红系2相关因子2（NRF2）蛋白表达水平升高。

作者贡献声明

Yalei Li：论文撰写——审阅与编辑，调查研究。Ting Su：论文撰写——审阅与编辑，调查研究。Leyuan Ji：论文撰写——审阅与编辑，调查研究。Renjie Tao：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——原始草稿，验证，项目管理，方法论，调查研究，资金获取，形式化分析。Qiyan Lin：论文撰写——审阅与编辑，项目管理，方法论，资金获取，形式化分析，概念化。Xia Li：论文撰写——审阅与编辑，

未引用的参考文献

Wang等，2026；Wang等，2023；Zhou等，2025。

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告规范）指南开展。本研究经西华大学科研伦理审查委员会批准。（批准号：202503006）

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在已知的可能影响本研究中报道工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到安徽省高校自然科学研究重点项目（编号：2024AH051997）、上海2025年创新生态建设方案"国产科技合作"项目（25010700500）、2022年安徽省平台协同创新项目（GXXT-2022-087）、安徽省中医药产业共性技术研究中心开放基金（编号：AHTCMGTRC-2023-08）以及Renjie Tao|Xia Li|Leyuan Ji|Yalei Li|Ting Su|Menghua Ma|Fangli Gu|Li Yang|Ning Zang|Cunwu Chen|Dong Liu|Qiyan Lin的启动基金资助。