《Journal of Chromatography B》：Development and validation of qualitative methods for the detection of GLP-1 receptor agonists in serum and dried blood spots by LC-HRMS/MS for doping control purposes
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全球肥胖患病率不断上升，加之对体重管理的日益关注，推动了以胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂（如司美格鲁肽（semaglutide）和替尔泊肽（tirzepatide））为代表的抗肥胖药物的广泛使用。尽管目前世界反兴奋剂机构（WADA）尚未禁止此类药物
全球肥胖患病率不断上升，加之对体重管理的日益关注，推动了以胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂（如司美格鲁肽（semaglutide）和替尔泊肽（tirzepatide））为代表的抗肥胖药物的广泛使用。尽管目前世界反兴奋剂机构（WADA）尚未禁止此类药物，但司美格鲁肽和替尔泊肽已分别自2024年和2026年起被纳入WADA监测计划，以评估其在赛内和赛外被滥用的可能性。本研究旨在开发灵敏的定性检测方法，用于在血清和干血斑（DBS）中检测皮下注射的GLP-1受体激动剂，包括艾塞那肽（exenatide）、利司那肽（lixisenatide）、利拉鲁肽（liraglutide）、司美格鲁肽和替尔泊肽，采用液相色谱-高分辨串联质谱（LC-HRMS/MS）技术。针对低丰度肽段（艾塞那肽、利司那肽和内源性GLP-1代谢物GLP-1(9–36)-NH2），采用基于磁珠的亲和纯化方法进行富集；而对于高丰度的脂化肽段（利拉鲁肽、司美格鲁肽和替尔泊肽），则采用混合模式阴离子交换固相萃取（SPE）方法。研究根据WADA国际实验室标准（ISL 11）对方法进行了验证，并在给药后的人体和鼠类样本中进行了概念验证。血清中艾塞那肽、利司那肽和GLP-1(9–36)-NH2的检出限（LOD）分别为9.4 pg/mL、48 pg/mL和48 pg/mL，干血斑中分别为85 pg/mL、185 pg/mL和未测定；血清中利拉鲁肽、司美格鲁肽和替尔泊肽的LOD分别为4.7 ng/mL、4.7 ng/mL和0.48 ng/mL，干血斑中分别为0.95 ng/mL、0.95 ng/mL和3.8 ng/mL。所有给药后的人体和鼠类血浆及干血斑样本均成功检出所给予的分析物，证实了所开发方法在实际反兴奋剂检测场景中的适用性。研究认为，鉴于艾塞那肽和利司那肽在临床实践中已较少使用，而司美格鲁肽和替尔泊肽已成为首选治疗药物，兴奋剂检测的重点应主要放在司美格鲁肽和替尔泊肽上。
基于LC-HRMS/MS的GLP-1受体激动剂血清与干血斑检测方法研究解读
一、研究背景与意义
全球肥胖患病率持续攀升，体重管理需求日益增长，推动了以胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂为代表的抗肥胖药物的广泛应用。GLP-1是一种由肠道L细胞在餐后分泌的内源性肠促胰岛素激素，其生物活性形式GLP-1(7–36)-NH2和GLP-1(7–37)因二肽基肽酶-4（DPP-4）等酶的快速降解而半衰期极短，不适合直接作为治疗药物。为此，多种GLP-1类似物被开发以克服药代动力学局限。第一代激动剂艾塞那肽和利司那肽半衰期短，需频繁注射；第二代激动剂利拉鲁肽、司美格鲁肽和替尔泊肽通过氨基酸替换和脂肪酸侧链修饰，实现可逆血浆蛋白结合和酶解抗性，显著改善了药代动力学和临床疗效。
尽管目前缺乏运动员使用的确凿证据，GLP-1受体激动剂理论上可能通过减重改善身体成分、刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌、潜在心血管获益及促进线粒体生物发生等机制，在体重分级项目、耐力项目和审美类项目中提供不公平竞争优势。目前WADA尚未禁止此类药物，但司美格鲁肽和替尔泊肽已分别自2024年和2026年起被纳入WADA监测计划。由于完整肽段在尿液中基本不可检出，且尿液代谢物缺乏结构特异性，血液基质中完整肽段的检测成为最可靠的策略。因此，开发灵敏可靠的血清和干血斑（DBS）检测方法对于兴奋剂检测至关重要。
二、主要技术方法
研究人员开发了两套样本制备策略：针对低丰度肽段（艾塞那肽、利司那肽、GLP-1(9–36)-NH2），采用偶联抗GLP-1抗体和GLP-1受体融合蛋白的磁珠亲和纯化；针对高丰度脂化肽段（利拉鲁肽、司美格鲁肽、替尔泊肽），采用混合模式阴离子交换固相萃取（SPE）。所有分析采用Thermo Fisher Scientific Vanquish UHPLC系统耦合Orbitrap Exploris 480质谱仪，配置两套液相色谱系统：LC-Setup 1含捕集柱和DMSO电离增强剂，用于低丰度肽段及DBS中高丰度肽段分析；LC-Setup 2无捕集柱和DMSO，用于血清中高丰度肽段分析。方法验证依据WADA国际实验室标准（ISL 11）进行。概念验证样本包括来自瑞士伯尔尼Inselspital门诊接受司美格鲁肽或替尔泊肽治疗的患者血浆和DBS样本，以及瑞士苏黎世联邦理工学院开展的雄性C57BL/6J小鼠艾塞那肽、利司那肽和利拉鲁肽给药后样本。
三、研究结果
3.1 利拉鲁肽、司美格鲁肽和替尔泊肽在血清和DBS中的检测
采用混合模式阴离子交换SPE结合LC-HRMS/MS，成功实现了三种脂化肽段在血清和DBS中的选择性、可靠检测。方法稳健性通过血浆替代血清、纤维素基DBS卡替代聚合物Mitra装置得到验证。血清中回收率约17–20%，DBS中约32–34%；血清中基质效应超过100%提示可能的离子增强，而DBS中替尔泊肽基质效应仅52%提示离子抑制。血清中利拉鲁肽和司美格鲁肽的检出限（LOD）为4.7 ng/mL，替尔泊肽为0.48 ng/mL；DBS中利拉鲁肽和司美格鲁肽LOD为0.95 ng/mL，替尔泊肽为3.8 ng/mL。尽管血清方法回收率中等，但所获灵敏度确保在治疗稳态浓度（>50 ng/mL）及更低亚治疗水平下可靠检出，后者可能反映运动员赛前停药场景。DBS方法存在可测的残留效应，但鉴于阳性样本在兴奋剂检测中罕见，可通过空白提取物冲洗和重分析管理。
3.2 艾塞那肽、利司那肽和GLP-1(9–36)-NH2在血清和DBS中的检测
采用磁珠亲和纯化结合LC-HRMS/MS，成功实现了低丰度肽段的高灵敏检测。血清中艾塞那肽LOD为9.4 pg/mL，利司那肽和GLP-1(9–36)-NH2均为48 pg/mL；DBS中艾塞那肽LOD为85 pg/mL，利司那肽为185 pg/mL。血清分析灵敏度落在治疗使用期间血浆峰浓度范围内，证实方法适用于实际用药后样本检测。GLP-1(9–36)-NH2因初始实验中700 pg/mL的LOD超过内源性血浆浓度，未纳入DBS方法验证。利司那肽在无基质溶剂中无法检出，归因于缺乏防止管壁吸附的基质成分，但在实际样本中不构成关键问题。DBS中利司那肽磁珠残留效应较血清升高，可能与全血基质复杂性有关。鉴于血清分析具有更优灵敏度，血清被推荐为艾塞那肽和利司那肽兴奋剂检测的首选基质。
3.3 给药后样本的概念验证
所有人体和鼠类给药后血浆及DBS样本均成功检出所给予的分析物，空白样本无相应峰，证实了所开发方法在实际体内样本中的适用性。局限性包括：方法验证在血清中进行而给药后样本为血浆（但稳健性测试已在血浆中验证）、患者药代动力学可能与健康运动员存在差异、鼠类药代动力学与人类不同、仅使用雄性小鼠无法评估性别依赖性差异。研究并非旨在评估药代动力学，而是验证定性方法对真实样本的适用性，该目标已成功实现。
四、讨论与结论
研究结论指出，在司美格鲁肽和替尔泊肽被纳入WADA监测计划后，需要可靠的GLP-1受体激动剂定性检测方法。血液（包括血清和DBS）被选为检测基质，因为完整肽段在尿液中通常不可检出，且尿液代谢物无法明确识别给药物质。对于高丰度脂化肽段，混合模式阴离子交换SPE适用于血清和DBS样本制备，因其长半衰期和高血浆浓度，DBS采样是血清分析的合适替代方案。对于低丰度肽段，亲和纯化实现了血清和DBS中的富集；DBS检测在高浓度下可行，但血清分析因更大样本体积提供更优灵敏度而被推荐。鉴于艾塞那肽和利司那肽在临床实践中已较少使用，而司美格鲁肽和替尔泊肽因更优疗效和药代动力学成为首选治疗药物，兴奋剂检测的重点应主要放在司美格鲁肽和替尔泊肽上。展望部分指出，DPP-4抑制剂通过抑制内源性GLP-1降解间接增强GLP-1信号，但其体重和血糖控制作用显著弱于GLP-1受体激动剂；未纳入研究的度拉糖肽（dulaglutide）因更大分子尺寸和不同结构特性需要酶解消化等替代分析策略；新型多受体激动剂（如retatrutide）和口服小分子激动剂（如orforglipron）的涌现，要求兴奋剂检测领域持续关注潜在滥用并发展相应分析框架。
