核靶向沉默EPIC1表达作为调控肿瘤免疫微环境及增强癌症免疫治疗的表观遗传策略

《Journal of Controlled Release》：Nucleus-targeted silencing of EPIC1 expression as an epigenetic strategy to modulate tumor immune microenvironment and potentiate cancer immunotherapy

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  开发了一种靶向细胞核的RNAi纳米平台，用于有效的癌症治疗。
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  该纳米平台能够在乳腺癌细胞中沉默定位于细胞核的EPIC1表达。
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  EPIC1沉默可通过上调肿瘤抑制基因来抑制乳腺癌肿瘤生长。
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  EPIC1沉默可通过上调免疫活性基因来增强乳腺癌免疫治疗的效果。

引言

以免疫检查点阻断（ICB）为代表的癌症免疫治疗已在临床中显示出显著疗效，但总体应答率仍然有限[1]。这一困境主要源于肿瘤免疫抑制微环境（TIME），该微环境可抑制免疫活性信号通路并对细胞毒性T细胞产生不利影响[2]，[3]。近年来，越来越多的证据表明，表观遗传调控（如，DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA修饰和非编码RNA）通过调节癌细胞和免疫细胞中免疫相关基因的表达，深刻影响着TIME[4]，[5]。例如，DNA启动子甲基化可抑制肿瘤细胞中I型干扰素（IFN）信号通路的活性，而阻断DNA甲基转移酶（DNMTs）（如DNMT1）的功能可显著增强癌症免疫治疗的疗效[6]。因此，靶向表观遗传调控目前已被认为是调节TIME和增强癌症免疫治疗的有效策略。

长链非编码RNA（lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA（ncRNAs），占人类基因组转录本的50%以上[7]，[8]，[9]。尽管lncRNAs缺乏蛋白质编码能力，但它们仍可通过与蛋白质、mRNA和DNA的相互作用发挥其生物学功能，如促进肿瘤细胞的生长和转移[9]，[10]。更重要的是，近期研究表明，lncRNAs还可作为表观遗传调控因子来调节TIME，因为它们可以通过募集多种表观遗传因子（如多梳抑制复合物2（PRC2）、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和DNMTs）来调节免疫相关基因的表达[11]，[12]。鉴于lncRNAs在调节TIME方面的重要作用及其细胞类型特异性表达模式，近年来大量研究致力于探索关键的免疫调节性lncRNAs并阐明其调节抗肿瘤免疫的分子机制。表观诱导MYC相互作用lncRNA 1（EPIC1）和转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）是两个代表性的lncRNAs，它们不仅能作为致癌驱动因子直接促进肿瘤细胞的生长和转移[13]，[14]，[15]，[16]，还能与其他表观遗传因子（如组蛋白甲基转移酶EZH2）相互作用，加剧TIME并增强肿瘤细胞的免疫逃逸[17]，[18]，[19]。除了在肿瘤细胞中发挥作用外，近期研究还发现，肿瘤细胞中的功能性lncRNAs可以以外泌体的形式分泌，从而表观遗传地调节免疫细胞的功能[20]，[21]，[22]。例如，来源于多发性骨髓瘤细胞的外泌体lncRNA核富集染色体转录本1（NEAT1）可通过与表观遗传因子EZH2相互作用来损害自然杀伤（NK）细胞的活性[20]。因此，靶向调节这些lncRNAs的表达可能同时阻断其致癌功能并调节TIME，从而增强癌症免疫治疗的效果。然而，大多数免疫调节性lncRNAs定位于膜性细胞器中（如，细胞核和线粒体）[23]，[24]，[25]，[26]，在体内有效调节其表达仍具有挑战性。

众所周知，lncRNAs主要从核基因组转录，广泛分布于细胞质和其他膜性细胞器中，包括细胞核、线粒体、内质网和核糖体[24]，[26]。对于细胞质中的lncRNAs，RNA干扰（RNAi）技术被认为是沉默其表达的最有效且最实用的方法[27]，[28]，[29]。此外，利用纳米粒子（NPs）在体内递送RNAi效应分子（如小干扰RNA（siRNA））进一步推动了RNAi技术的临床转化，因为经过设计的纳米粒子可以保护siRNA免受血清核酸酶的降解，并促进其进入靶细胞[30]，[31]，[32]。然而，这些纳米粒子介导的siRNA递送系统无法有效沉默定位于膜性细胞器中的lncRNAs的表达，因为双层膜结构保护了细胞器内部，阻碍了siRNA的进入[24]，[25]，[26]。一个理想的用于高效沉默细胞器定位lncRNAs的siRNA递送系统应具备克服多重细胞外和细胞内屏障的能力，包括核酸酶降解、肿瘤积累不足、细胞摄取有限、内体捕获和细胞器内转运受限等[33]。近年来，开发了多种细胞器靶向纳米粒子用于精准药物递送和癌症治疗[26]，[34]，[35]，[36]，[37]，[38]。这些纳米粒子不仅能增强治疗药物（如，化疗药物）在肿瘤中的积累并促进其进入肿瘤细胞，还能显著提高治疗药物在细胞器中的浓度，以低剂量实现更好的抗肿瘤效果[39]，[40]，[41]，[42]。因此，将细胞器靶向策略与RNAi技术相结合有望有效调节细胞器定位的lncRNA表达，从而表观遗传地调节TIME并增强癌症免疫治疗的效果。然而，据我们所知，目前尚未有研究探索具备这些独特特性的治疗平台。

在此，我们开发了一种靶向细胞核的RNAi纳米平台，用于特异性沉默定位于细胞核的EPIC1表达并表观遗传地调节TIME，以增强乳腺癌（BCa）免疫治疗的效果（图1）。该纳米平台将内体pH响应性共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚（2-（二异丙氨基）乙基甲基丙烯酸酯）（Meo-PEG-b-PDPA）与细胞核靶向肽两亲物（NTPA）相结合，后者可通过静电相互作用结合EPIC1 siRNA（siEPIC1）。在原位移植和转移性乳腺癌模型中，该靶向细胞核的RNAi纳米平台可在肿瘤组织中高度富集并高效沉默乳腺癌细胞中的EPIC1表达。通过这种高效的EPIC1沉默，表观遗传因子EZH2催化其靶基因启动子区域组蛋白H3赖氨酸27甲基化（H3K27me3）的功能被阻断，这不仅可通过上调肿瘤抑制基因（如，BAX和TP53）的表达直接抑制肿瘤生长，还可促进关键免疫活性基因（如，MHC-I、IFN-β、CXCL9和CXCL10）的表达，改善树突状细胞（DCs）的成熟以及细胞毒性CD8⁺T细胞的肿瘤浸润和肿瘤杀伤能力，从而增强免疫治疗效果。

章节摘要

材料

二甲基亚砜（DMSO）和N,N′-二甲基甲酰胺（DMF）购自Sigma-Aldrich，直接用于实验。Meo-PEG₁₁₃-b-PDPA₈₀共聚物（M_n = 2.27 × 10⁴，M_w/M_n = 1.09）和阳离子脂质类似化合物烷基修饰聚酰胺胺（PAMAM）树枝状分子（G0-C14）均按照我们之前的研究合成[40]，[41]，[42]。细胞核靶向肽-两亲物（NTPA，C₁₇H₃₅CONH-PKKKRKVRRRR-OH）由上海格利生物医药科技有限公司合成。Hoechst 33342（#62249）、D-荧光素

用于EPIC1沉默的靶向细胞核RNAi纳米平台的制备

作为重要的表观遗传调控因子，EPIC1此前已被确认为一种致癌性lncRNA，可促进多种癌症类型（如，肺癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌）的进展[13]，[14]，[15]。近年来，越来越多的证据表明，EPIC1在调节TIME方面也发挥重要作用[17]，[18]，[19]。因此，靶向沉默EPIC1的表达有望同时阻断其在癌症进展中的致癌作用并增强癌症

结论

我们设计并开发了一种靶向细胞核的RNAi纳米平台，能够特异性沉默定位于细胞核的EPIC1表达并增强乳腺癌免疫治疗的效果。实验结果表明，该靶向细胞核的RNAi纳米平台可在肿瘤组织中高度富集，并被乳腺癌细胞高效摄取，实现siEPIC1的细胞核递送和EPIC1表达的特异性沉默。通过这种高效的EPIC1沉默，表观遗传因子EZH2的

CRediT作者贡献声明

黄林卓：撰写——初稿，方法论，调查，概念构思。徐锐：撰写——初稿，可视化，调查，概念构思。林春昊：撰写——初稿，验证，方法论，调查。刘敏：验证，调查。卓心颖：验证，方法论，调查。赵子轩：可视化，方法论，调查。李蓉：验证，方法论，调查。陈金金：撰写——审稿与编辑，监督，

利益冲突声明

作者声明不存在已知的与本文报告工作相冲突的经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到国家自然科学基金委员会（82573342、82503542、82403670和52473328）、广东省基础与应用基础研究基金（2024B1515040006）、广东省科技计划项目（2023B1111030006）、湖南省重点实验室基金（2023TP1014）、中国博士后科学基金会（2025 M772049）以及中山大学孙逸仙纪念医院高层次人才培养专项经费"三年三百万"项目资助

黄林卓|徐锐|林春昊|刘敏|卓心颖|赵子轩|李蓉|陈金金|徐暁定