《Journal of Agriculture and Food Research》：Novel tyrosinase inhibitory peptides from
Kaempferia parviflora protein hydrolysate with melanin suppression and mechanistic insights from B16F10 cells and zebrafish models
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从黑姜（Kaempferia parviflora）蛋白水解物中鉴定出新型酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）抑制肽YQ-7（YGRGPIQ）与YA-9（YNYGPAGQA）。其中，YA-9较YQ-7表现出更强的酪氨酸酶抑制活性，且呈竞争性
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从黑姜（Kaempferia parviflora）蛋白水解物中鉴定出新型酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）抑制肽YQ-7（YGRGPIQ）与YA-9（YNYGPAGQA）。其中，YA-9较YQ-7表现出更强的酪氨酸酶抑制活性，且呈竞争性抑制动力学特征。在B16F10小鼠黑色素瘤细胞模型中，两种肽均能抑制细胞内酪氨酸酶活性并减少黑色素生成。在转录及蛋白水平上，黑色素生成相关标志物——小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor, MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）及酪氨酸酶相关蛋白-2（TRP-2）均出现下调。此外，斑马鱼胚胎实验显示YA-9具有较低的发育毒性，支持其安全性。上述发现表明，来源于黑姜蛋白水解物的YQ-7与YA-9可作为潜在的抗黑色素生成活性肽，在皮肤美白及色素沉着相关应用中具有开发前景。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
皮肤色素沉着过度是临床常见的皮肤问题，其表现形式包括炎症后色素沉着、黄褐斑、老年斑及雀斑等。黑色素的合成起始于黑素小体内一系列受细胞氧化还原状态及铜离子稳态调控的氧化反应，其中酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）作为含双核铜离子的限速酶，催化L-酪氨酸羟化为L-多巴（L-DOPA），并进一步氧化L-DOPA为多巴醌，后者依硫醇可用性与细胞氧化还原环境分支形成真黑素或褐黑素。因此，抑制酪氨酸酶活性被视为减少色素沉着的关键策略。此外，黑色素生成还受信号通路与转录网络的调控，α-黑色素细胞刺激素（α-MSH）激活MC1R及下游cAMP/PKA信号，促进CREB活化及小眼畸形相关转录因子（MITF）表达，进而上调TYR及酪氨酸酶相关蛋白TRP-1和TRP-2，最终增加黑色素产量。
目前临床及化妆品中常用的酪氨酸酶抑制剂包括氢醌（hydroquinone, HQ）、熊果苷（arbutin）和曲酸（kojic acid, KA）。然而，氢醌虽被视为脱色“金标准”，但长期或过量使用可导致皮肤刺激及外源性褐黄病，且因潜在致癌风险在化妆品中受限；熊果苷与曲酸安全性较好但功效有限，且存在稳定性与配方难题。因此，研究者日益关注来源于天然产物的酪氨酸酶抑制肽（tyrosinase inhibitory peptides, TIPs），这类肽可通过竞争性或非竞争性结合酪氨酸酶、干扰铜依赖性催化环境、螯合铜离子或调控黑色素生成相关通路等多种序列依赖性机制发挥抗黑色素生成作用。
黑姜（Kaempferia parviflora，泰国药用姜科植物）此前的研究多集中于其亲脂性多甲氧基黄酮类化合物（polymethoxyflavones, PMFs），而对其蛋白来源肽段的抗黑色素生成潜力关注甚少。值得注意的是，近期肽组学分析表明黑姜根茎含有可检测的内源性肽，适合开展基于质谱的系统性生物活性肽发现研究。同科植物来源的短肽已被证实可通过活性位点结合、竞争性抑制动力学及抑制黑色素生成通路发挥酪氨酸酶抑制作用，例如来源于Curcuma wanenlueanga的VY-8（VAPVSLSY）与FF-6（FDNSYF）肽，以及来源于Zingiber cassumunar的活性肽。然而，黑姜蛋白水解物中序列明确的酪氨酸酶抑制肽此前尚未被表征。本研究旨在利用黑姜这一未充分利用的植物蛋白资源，系统开展酪氨酸酶抑制肽的发现及其抗黑色素生成机制研究。
二、研究内容概述
研究人员以泰国种植的黑姜新鲜根茎为原料，经盐提与硫酸铵沉淀获得粗蛋白，再以菠萝蛋白酶（bromelain）进行酶解制备蛋白水解物。随后依次采用超滤（ultrafiltration, UF）按分子量分级、反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，并经纳升液相色谱-串联质谱（nanoLC–ESI–MS/MS）鉴定肽序列，最终获得两条新型酪氨酸酶抑制肽YQ-7（YGRGPIQ）与YA-9（YNYGPAGQA），经Fmoc固相肽合成法合成并纯化至≥98%纯度。研究人员进一步通过酶动力学分析、分子对接、B16F10细胞实验（细胞活力、细胞内酪氨酸酶活性、黑色素含量、实时荧光定量PCR、Western blot）及斑马鱼胚胎实验，系统评价了这两条肽的抑制机制、抗黑色素生成效果及安全性。
三、关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术手段：以菠萝蛋白酶水解黑姜粗蛋白制备水解物；以超滤膜按分子量截留值（10 kDa、5 kDa、3 kDa、0.65 kDa）分级；以RP-HPLC（C18色谱柱）纯化活性组分；以nanoLC–ESI–MS/MS鉴定肽序列并经Mascot数据库检索确认；以Fmoc固相肽合成法合成目标肽；以Lineweaver–Burk双倒数作图分析酶抑制动力学类型并计算抑制常数（Ki）；以HDOCK网络服务器进行蛋白-肽分子对接并借助Discovery Studio Visualizer分析相互作用；以B16F10小鼠黑色素瘤细胞模型评价细胞活力（MTT法）、细胞内酪氨酸酶活性、黑色素含量及相关基因和蛋白表达；以斑马鱼胚胎模型评价急性发育毒性与黑色素抑制效果。植物材料经分类学鉴定并存放于玛希隆大学植物标本馆（PBM，编号PBM 006568，证书号022/2025），斑马鱼实验经泰国国家科学技术发展 agency 机构动物护理与使用委员会批准（IACUC, NSTDA；批准号006-2567）。
四、研究结果
4.1 黑姜蛋白水解物的制备与分级
研究人员以盐提结合硫酸铵沉淀法从黑姜新鲜根茎中提取粗蛋白，经菠萝蛋白酶在底物与酶比20:1（w/w）、pH 7.0、50°C条件下酶解6小时获得蛋白水解物。水解物经不同分子量截留值的超滤膜分级后获得五个肽组分（>10 kDa、5–10 kDa、3–5 kDa、0.65–3 kDa、<0.65 kDa），对各组分进行酪氨酸酶抑制活性测定，筛选出活性最强的组分进入后续纯化。
4.2 肽的纯化与序列鉴定
活性最强的超滤组分经RP-HPLC进一步纯化，收集显著色谱峰对应的组分并再次测定酪氨酸酶抑制活性。活性最高的RP-HPLC组分经nanoLC–ESI–MS/MS分析，鉴定出两条肽序列YQ-7（YGRGPIQ）与YA-9（YNYGPAGQA），经Mascot数据库检索确认（置信度≥95%），并经BLASTp比对评估序列同源性。
4.3 肽的理化性质与安全性预测
经在线生物信息学工具（Peptide2、Innovagen、ToxinPred）预测，两条肽的理化性质、溶解度及毒性特征被系统注释，为候选肽的筛选提供依据。
4.4 酪氨酸酶抑制活性与动力学特征
以蘑菇酪氨酸酶为酶源、L-酪氨酸（单酚酶底物）和L-DOPA（二酚酶底物）为底物进行抑制活性测定。结果显示YA-9的酪氨酸酶抑制活性强于YQ-7。酶动力学分析（Lineweaver–Burk双倒数作图）表明，YA-9呈竞争性抑制模式，其抑制常数（Ki）通过斜率对肽浓度的二次作图估算。
4.5 分子对接分析
以Agaricus bisporus酪氨酸酶晶体结构（PDB ID: 2Y9X）为受体，经AMBER 20能量最小化后，利用HDOCK服务器进行蛋白-肽对接。对接结果显示两条肽均能结合于酪氨酸酶活性位点区域，通过氢键、疏水相互作用、盐桥及芳香相互作用等与酶形成稳定复合物，其中YA-9的对接评分更低，与其更强的抑制活性一致。
4.6 细胞活力评价
MTT法检测显示，在实验所用浓度范围内，YQ-7与YA-9对B16F10细胞活力无显著影响，表明两条肽在该浓度范围内无细胞毒性。
4.7 细胞内酪氨酸酶活性与黑色素含量
在未刺激的B16F10细胞模型中，YQ-7与YA-9处理48小时后，细胞内酪氨酸酶活性（以L-DOPA氧化速率衡量）显著降低，黑色素含量（碱溶法测定）亦呈剂量依赖性下降，且效果优于阳性对照熊果苷（0.2 mM）。
4.8 黑色素生成相关基因与蛋白表达
实时荧光定量PCR结果显示，YQ-7与YA-9处理后，Mitf、Tyr、Trp-1、Trp-2的mRNA表达水平均显著下调。Western blot分析进一步证实，MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表达水平同样降低，表明两条肽在转录及蛋白水平上均能抑制黑色素生成通路。
4.9 斑马鱼胚胎毒性及黑色素抑制评价
斑马鱼胚胎暴露于YA-9（20–100 μM）48小时后，未观察到显著的急性发育毒性，死亡率与阴性对照无显著差异。同时，YA-9处理组斑马鱼胚胎的色素沉着明显减少，表明其在整体动物水平上具有黑色素抑制效果。以3,4-二氯苯胺（3,4-DCA）和1-苯基-2-硫脲（PTU）分别作为急性毒性与黑色素抑制的阳性对照。
五、讨论与结论
本研究首次从黑姜蛋白水解物中鉴定出两条序列明确的酪氨酸酶抑制肽YQ-7与YA-9，填补了该植物蛋白来源活性肽研究的空白。研究结果表明，YA-9通过竞争性抑制酪氨酸酶活性发挥直接抑制作用，而两条肽均能在细胞水平通过下调MITF及其下游靶基因（TYR、TRP-1、TRP-2）的表达来抑制黑色素生成，体现了酶活性直接抑制与通路调控的双重机制。分子对接分析为肽与酪氨酸酶活性位点的结合模式提供了结构层面的解释。斑马鱼胚胎实验进一步验证了YA-9在整体动物模型中的黑色素抑制效果及其低发育毒性，支持其安全性。上述发现为黑姜蛋白肽在皮肤美白、色素沉着相关护肤及功能性食品领域的应用提供了科学依据，也为天然来源酪氨酸酶抑制肽的理性筛选与开发提供了新的候选分子。
