《JDS Communications》：Evidence of putative persistence of bacterial spores in a dairy processing environment
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细菌孢子广泛存在于原料乳中，并能在高温短时（high temperature, short time, HTST）巴氏杀菌中存活，是乳制品腐败的公认隐患。由于其具有抗性并倾向于占据环境生态位，细菌孢子也可能存在于食品加工环境中，最终通过交叉污染进入加工乳制品，
细菌孢子广泛存在于原料乳中，并能在高温短时（high temperature, short time, HTST）巴氏杀菌中存活，是乳制品腐败的公认隐患。由于其具有抗性并倾向于占据环境生态位，细菌孢子也可能存在于食品加工环境中，最终通过交叉污染进入加工乳制品，但迄今针对加工环境中乳品相关孢子的研究甚少。在此，研究人员旨在对某乳品加工设施内14个环境位点在3次独立采样事件中分离得到的主要细菌孢子进行计数和鉴定。为此，对来自环境海绵拭子的样本（n = 42）进行了嗜中温孢子检测（mesophilic spore test），包括嗜中温孢子计数（mesophilic spore count, MSC）和嗜中温最大概率数（most probable number, MPN）孢子试验。采集自加工设施的海绵拭子经80°C热处理12分钟，随后结合MPN技术以评估低水平污染，并使用标准方法琼脂倾注平板法以覆盖广泛的潜在孢子浓度范围。14个环境位点的平均孢子计数范围为?1.34 log MPN/mL至3.86 log cfu/mL，标准差为1.47 log cfu/mL，表明各位点在浓度与变异性上均存在巨大差异。通用操作台与microthermics台式设备的平均孢子计数最高，而喷雾干燥粉末喷嘴外部和HTST巴氏杀菌器外部的平均孢子计数最低。选取代表独特菌落形态的分离株，利用rpoB基因测序进行特征鉴定。成功测序的133株分离株涵盖14个属、42个种及55种独特的rpoB等位基因型，其中53株分属25种此前未被描述的新等位基因型。分离到的最常见属为Bacillus和Paenibacillus，分别占分离株的34.6%和22.6%。其他属包括Cytobacillus（15.8%）、Niallia（8.3%）及其他（18.8%）。在分离自加工环境的Bacillus中，B. subtilis s.l. Clade1和B. cereus group最为常见。此外，研究人员观察到相同rpoB等位基因型的芽孢形成菌在多个采样事件中反复分离自相同位点，提示其在该加工环境中可能存在潜在持久性。总体而言，研究结果表明乳品加工环境可能藏匿与乳制品质量和安全密切相关的孢子。未来研究应进一步考察加工环境中的孢子，并制定策略以防止其进入乳制品，从而减少食物浪费、延长产品保质期并降低公共卫生风险。
细菌孢子能够耐受巴氏杀菌并引起乳制品腐败，是乳品行业长期关注的微生物类群。由于孢子具有高度环境抗性和生态位适应性，食品加工环境可能成为其蓄积库，并通过交叉污染进入终产品。然而，目前针对乳品加工环境中孢子污染的系统研究十分有限，仅有一项研究曾对加工环境中的芽孢形成菌进行分离鉴定。为此，研究人员选择一家同时加工乳制品和非乳制品的试验工厂，在其内部选取14个环境位点，在3个采样事件（间隔约1周）中采集环境海绵拭子样本共42份，开展嗜中温孢子计数、分离与分子鉴定，以揭示乳品加工环境中孢子的浓度、多样性及潜在持久性。
在技术方法上，研究人员将海绵拭子样本在80°C热处理12分钟，以杀灭营养体并激活孢子萌发；随后采用最大概率数（MPN）法和倾注平板法分别对低水平和较广范围的孢子进行计数。对分离菌株选取不同菌落形态的代表，进行rpoB基因632-核苷酸片段测序分型；对rpoB测序失败的菌株，进一步扩增约700-核苷酸片段的16S rRNA基因用于鉴定。序列与Food Microbe Tracker数据库比对，确定属、种及rpoB等位基因型（allelic type, AT）。样本来源为一家试验工厂的14个环境位点，共42份拭子样本。
在孢子计数与位点变异性方面，不同位点的平均孢子浓度跨度为?1.34 log MPN/mL至3.86 log cfu/mL，总体标准差为1.47 log cfu/mL，表明位点间孢子污染程度差异显著。通用操作台2、microthermics台式设备及通用操作台1的计数最高，分别达3.86、3.52和2.81 log cfu/mL；而HTST巴氏杀菌器外部、喷雾干燥粉末喷嘴外部及不锈钢锅的计数最低，分别为?1.34 log MPN/mL、?1.15 log MPN/mL和0.33 log cfu/mL。同一地点在不同采样时间的计数也存在较大波动，其中HTST巴氏杀菌器外部、移动存储车和喷雾干燥粉末喷嘴外部的标准差分别达1.67、1.65和1.37 log cfu/mL，而通用水槽、电脑键盘和设备盖1的标准差仅为0.03、0.05和0.11 log cfu/mL，说明部分位点具有相对稳定的污染水平，部分位点则高度动态。
在分离株分类鉴定方面，从42份样本中共获得148株分离株，其中133株成功表征（123株基于rpoB测序，10株基于16S rRNA测序）。这些菌株涵盖14个属、42个种和55种rpoB等位基因型，其中53株代表25种先前未描述的新等位基因型。最常见的属为Bacillus（34.6%）和Paenibacillus（22.6%），其次为Cytobacillus（15.8%）、Niallia（8.3%）及其他属（18.8%）。在Bacillus属中，B. subtilis s.l. Clade1和B. cereus group分离频率最高。
在潜在持久性证据方面，研究人员通过比较不同采样事件中相同位点的rpoB等位基因型，发现AT2591（Cytobacillus eiseniae）、AT2589（Cytobacillus sp.）和AT2590（Niallia taxi）各自均在单个位点的所有3次采样中被重复分离，AT159（Paenibacillus glucanolyticus）也在多个位点被多次检出。这些重复出现的等位基因型提示孢子可能在加工环境中存在潜在持久性，但研究人员也明确表示不能排除遗传相似菌株被反复引入的可能性。
讨论部分指出，孢子浓度的时空变异可能与清洁消毒频次、湿度、温度、粉尘负荷及靠近外部入口等因素有关。B. cereus群成员与乳制品品质和食源性安全密切相关，且能在加工环境常见表面形成生物膜，提示其可能在加工环境中定殖。Paenibacillus属细菌是冷藏乳制品腐败的重要贡献者，其在加工环境中的存在增加了产品污染风险。此外，大量新等位基因型的出现可能反映了加工环境对芽孢形成菌的独特选择压力，如消毒剂和低水分条件。未来研究应进一步探索孢子进入乳制品的传播途径及有效干预措施。
结论部分可翻译为：综上所述，乳品加工环境中的细菌孢子是一个潜在重要且尚未被充分研究的领域。在此，研究人员对一家试验工厂加工环境中的芽孢形成菌进行了计数和特征鉴定，发现了高且随时间变化的嗜中温孢子计数、多个rpoB等位基因型在多个位点的潜在持久性，以及归属于先前与乳制品质量、安全和合规性相关分类单元的rpoB等位基因型。鉴于本研究旨在探索而非全面调查，数据存在一定局限性：其一，仅对一家乳品加工设施中的14个位点进行了采样；其二，采样时间表未考虑工厂的清洁和卫生计划，该计划可能影响环境中孢子的存在和水平。未来应进一步研究乳品加工环境中芽孢形成菌的种群动态、持久性机制、向乳制品的传播途径以及有效的控制策略。
