《Scientific Reports》：Single-nucleus transcriptomics reveals multicellular remodeling beyond the aganglionic segment in Hirschsprung disease
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先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HSCR）以远端肠管肠神经节细胞缺失为特征，然而在切除无神经节细胞肠段后，术后肠功能障碍及Hirschsprung相关性小肠结肠炎（Hirschsprung-associated enterocoliti
先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HSCR）以远端肠管肠神经节细胞缺失为特征，然而在切除无神经节细胞肠段后，术后肠功能障碍及Hirschsprung相关性小肠结肠炎（Hirschsprung-associated enterocolitis，HAEC）仍可持续存在。研究人员构建了来自3例短段型HSCR患儿的神经节段、移行段及无神经节段结肠，以及3例年龄匹配对照婴儿横结肠组织的分段解析单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）图谱。经质量控制后，共保留93,256个细胞核，注释为14种主要结肠细胞类型。HSCR神经节段肠神经元中，与突触组织、神经元突起发育、神经传递及胆碱能突触相关的分子程序呈现低表达。肠胶质细胞表现出组成性重塑，而经典肠胶质细胞呈现炎症相关的转录改变。基质细胞分析提示分段特异性重塑，神经节段及移行段中炎症相关S4成纤维细胞相对富集，而无神经节段中肌成纤维细胞及胶原沉积更为显著。神经节段上皮细胞在屏障稳态相关程序中呈现转录改变。CellChat分析进一步提示候选的基质–上皮及神经元–胶质细胞通讯网络重塑。上述发现提供了人类单核资源，并就HSCR受累肠管中分段特异性多元细胞重塑产生可检验的假说。
一、研究背景与科学问题
先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HSCR）是一种由胚胎期肠神经嵴细胞（enteric neural crest cells，ENCCs）定植缺陷引起的先天性肠神经系统（enteric nervous system，ENS）疾病，其核心病理特征为远端肠管神经节细胞缺失，导致持续性痉挛、功能性梗阻及近端扩张。短段型HSCR是本研究关注的最常见亚型。
尽管切除无神经节肠段仍是主要治疗手段，部分患者术后仍持续存在便秘、大便失禁及Hirschsprung相关性小肠结肠炎（HAEC）。越来越多的证据提示，术后保留的近端有神经节肠段并非生物学上完全正常：既往研究报道该区域存在神经元异常，上皮屏障破坏及神经元交互改变亦与HAEC相关。然而，神经元、胶质细胞、基质细胞及上皮细胞如何跨HSCR肠段发生改变，此前认识极为有限。
现有模型存在明显局限：动物模型无法完全模拟人类肠道发育及微环境调控；患者来源iPSC及ENCC系统主要模拟早期发育缺陷；传统单细胞RNA测序（scRNA-seq）需活性细胞悬液，易低估肠神经元及平滑肌细胞等大型或脆弱细胞类型。单核RNA测序（snRNA-seq）可应用于冻存组织而不依赖完整活细胞，为直接在手术获取的人体标本中解析这些细胞群提供了可行途径。
二、研究内容与总体结论
研究人员对3例短段型HSCR患儿的神经节段、移行段及无神经节段结肠，以及3例年龄匹配对照婴儿横结肠组织进行snRNA-seq分析，构建了分段解析的HSCR结肠单核转录组图谱。经质量控制、双细胞去除及环境RNA校正后保留93,256个细胞核，注释为14种主要结肠细胞类型。研究核心发现：HSCR分子改变不仅局限于无神经节段，还广泛涉及术后保留的神经节段中多种细胞群——肠神经元突触及神经传递相关程序低表达，经典肠胶质细胞呈现炎症相关转录改变，炎症相关S4成纤维细胞在神经节段及移行段相对富集，无神经节段肌成纤维细胞及胶原沉积更显著，上皮细胞呈现屏障稳态相关转录改变，细胞间通讯网络亦发生重塑。该图谱为理解HSCR术后持续症状的细胞基础提供了重要资源。
三、关键技术与方法
研究采用的主要技术方法包括：对3例短段型HSCR患儿（神经节段、移行段、无神经节段）及3例年龄匹配对照婴儿（横结肠）的冻存结肠组织进行单核RNA测序（snRNA-seq），使用MGI DNBelab C系列平台建库、DNBSEQ-T7平台测序；通过DoubletFinder去除双细胞、DecontX校正环境RNA污染；使用Harmony进行批次校正，Seurat进行聚类与细胞注释；对关键细胞群进行亚聚类分析；采用DESeq2进行样本水平伪bulk差异表达分析；使用clusterProfiler进行GO及KEGG富集分析，采用基因集富集分析（GSEA）；使用Monocle 2对平滑肌细胞进行拟时间轨迹分析；使用CellChat推断细胞间通讯；通过Masson三色染色评估组织水平胶原沉积。
四、主要研究结果
HSCR受累结肠段单核图谱：经质量控制后保留93,256个细胞核，注释为14种主要结肠细胞类型，涵盖上皮、基质、内皮、免疫、神经元及胶质细胞群。所有主要细胞群在对照及HSCR样本中均被检出，但相对比例在不同肠段及个体间存在差异。
HSCR神经节段肠神经元突触及神经传递相关分子程序低表达：神经元亚聚类鉴定出兴奋性运动神经元（EMN）、ENS祖细胞样细胞、NOS1?抑制性运动神经元及VIP?抑制性运动神经元四个亚群。差异表达分析显示，HSCR神经节段神经元中PENK及AGRN等基因相对低表达；GO富集分析提示神经元突起发育、树突发育、突触组织、跨突触信号、化学突触传递、离子通道活性及乙酰胆碱结合相关程序下调；KEGG分析富集到胆碱能突触相关基因。伪bulk GSEA进一步证实突触后信号、突触后膜电位、树突发育、突触后组织、化学突触传递及神经元突起发育等基因集向对照方向富集。该分析仅含4个生物学样本，结论属探索性。
肠胶质细胞重塑及HSCR神经节段炎症相关转录改变：胶质细胞亚聚类鉴定出经典肠胶质细胞及Schwann样胶质细胞两个亚群。经典肠胶质细胞在对照中占主导，而Schwann样胶质细胞在HSCR受累肠段中相对比例增加，在移行段及无神经节段中最高。经典肠胶质细胞中，细胞因子产生、防御反应及白细胞活化相关基因集向HSCR神经节段方向富集，而细胞外基质（ECM）结构成分、基底膜、含胶原ECM、基质组织、胶原纤维组织及整合素结合相关程序向对照方向富集。Schwann样胶质细胞中ECM相关基因集在神经节段与无神经节段间呈现相反富集方向，不支持无神经节段中结构ECM转录程序一致升高。
成纤维细胞及平滑肌细胞分析揭示HSCR分段特异性基质重塑：成纤维细胞亚聚类鉴定出S1–S4成纤维细胞及肌成纤维细胞五个亚群。S3成纤维细胞在对照结肠中占比最高，在HSCR受累肠段中相对贡献降低；S4成纤维细胞在神经节段及移行段相对富集；S2成纤维细胞及肌成纤维细胞在无神经节段中相对贡献更大。配对伪bulk GSEA显示，matrisome相关蛋白、ECM调节因子、ECM糖蛋白及核心matrisome基因集向无神经节段显著富集，而胶原及基底膜基因集无显著富集；leading-edge分析鉴定出ADAMTS家族成员、MMP2、TIMP2、PLAU、PLAT、TGM2、POSTN及FBLN1等ECM重塑基因在无神经节段成纤维细胞中表达较高。平滑肌细胞解析为收缩型及合成型两种状态，拟时间分析显示其沿转录连续体分布；样本水平模块评分未显示收缩程序一致升高，合成/基质重塑相关评分在HSCR受累肠段中普遍降低。Masson三色染色显示无神经节段胶原沉积较对照结肠增加，胶原阳性面积定量证实该差异。
HSCR神经节段上皮细胞呈现屏障稳态相关转录改变：上皮细胞亚聚类鉴定出BEST4?肠上皮细胞、循环转运扩增细胞、肠上皮细胞、肠内分泌细胞1/2、杯状细胞、干细胞及转运扩增细胞八个亚群。各亚群比例在样本间存在差异，但无一致性的扩增或耗竭。杯状细胞中，伤口愈合、ERBB信号、肌动蛋白细胞骨架组织、黏附连接及紧密连接相关程序向HSCR神经节段方向富集，而翻译、内质网蛋白加工、ER–高尔基相关程序及抗原加工呈递向对照方向富集。肠上皮细胞中，矿物质吸收、金属离子应答及锌稳态相关程序向HSCR神经节段方向富集，而含胶原ECM、基底膜、ECM结构成分、整合素结合及免疫球蛋白复合物相关程序向对照方向富集。上皮差异主要体现于转录水平而非亚群比例变化。
CellChat分析鉴定HSCR神经节段候选通讯改变：HSCR神经节段样本推断的细胞间相互作用数量及总体强度高于对照。差异信息流涉及生长因子及组织重塑相关通路（EGF、IGF、NRG、NOTCH）、连接及黏附相关通路（CLDN、DESMOSOME、CEACAM）及ECM相关通路（LAMININ、FN1、THBS、COLLAGEN）。配体–受体分析鉴定出基质、上皮及ENS相关细胞群间的候选相互作用，神经元–胶质细胞方向涉及层粘连蛋白相关ECM组分、NRG–ERBB信号及轴突导向相关配体–受体对。该结果属转录组推断，不直接证明空间邻近或功能性信号传导。
五、讨论与结论
讨论部分指出，HSCR神经节段神经元中突触及神经传递相关程序低表达，结合亚群分布总体相似，提示保留肠段内神经元转录状态发生改变，但不直接证明突触传递或肠蠕动功能受损。胶质重塑在胶质亚型及肠段间呈异质性，经典肠胶质细胞以炎症相关转录改变为主，Schwann样胶质细胞ECM相关转录方向相反。成纤维细胞重塑呈分段相关模式：炎症相关S4成纤维细胞在近端更明显，肌成纤维细胞在远端无神经节段更突出；无神经节段转录改变集中于基质调控与重塑而非广泛结构ECM合成增加。平滑肌细胞未呈现平行的基质重塑程序升高。Masson染色显示无神经节段胶原沉积增加，但该组织水平变化与单细胞群胶原相关转录不完全平行，提示基质累积受合成、降解、组织及周转等多因素调控。杯状细胞及肠上皮细胞转录改变涉及黏膜稳态相关多种过程，而非单一屏障通路的统一改变。CellChat推断的ECM及黏附相关配体–受体对突出，为胶质、基质及上皮改变提供了可能联系；NRG–ERBB及轴突导向相关交互可能关联神经元与胶质改变。
研究主要局限包括：仅3例HSCR及3例对照，统计效力有限；对照组织取自肛门直肠畸形手术患儿而非健康供体，且全部来自横结肠，与HSCR远端结肠样本存在解剖部位不匹配，无法完全区分疾病效应与区域差异；ENS细胞群捕获不均，神经元分析最终仅含2例对照及2例HSCR神经节段样本；snRNA-seq仅测量核转录本，不直接反映胞质RNA丰度、蛋白表达、组织结构或细胞功能；CellChat推断的通讯模式不能确证物理邻近或下游信号。
研究结论：该分段解析图谱表明，HSCR肠管的分子改变超出无神经节段范围，涉及术后保留的神经节段中多种细胞群。这些改变如何影响术后肠功能，仍是亟待回答的重要问题。
