《Antioxidants》：Measurement of Lipid Oxidation in Foods and Selected Biological Systems Using LC-MS/MS-Based Lipidomics
脂质氧化是影响食品品质和氧化稳定性的重要因素，但传统氧化指标对单一氧化产物及脂质种类变化所提供的信息有限。本综述聚焦于基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的脂质氧化分析方法及其在食品和特定生物体系中的应用。LC-MS/MS能够提供单一氧化产物和氧化脂质种类在分子水平上的信息；然而，其分析可靠性可能受到氢过氧化物不稳定性、基质效应、缺乏真实标准品以及数据处理和脂质注释差异的影响。本文描述了氢过氧化物、醛、醇、酮、有机酸、碳氢化合物及氧化复合脂质的分析特征，同时阐述了LC-MS/MS分析的优势与局限。此外，本综述比较了靶向分析与非靶向及伪靶向脂质组学，并讨论了它们在食用油、肉制品、乳液和油体中的应用。还讨论了脂质组学在特定生物体系中的应用以及人工智能（AI）辅助脂质分析。因此，将经过验证的靶向分析和脂质组学与传统氧化指标相结合，可为脂质氧化提供更可靠、更全面的评价。
1. 引言
脂质是决定食品感官特性和营养价值的主要成分。然而，在烹饪、加工和储存过程中，脂质在氧气、热、光、金属离子等因素诱导下发生氧化，导致品质劣变。脂质氧化通常经历引发、传播和终止阶段。在这一过程中，氢过氧化物首先作为初级氧化产物形成，随后分解为各种低分子量次级氧化产物，包括醛、酮、醇、有机酸和碳氢化合物。富含多不饱和脂肪酸（PUFAs）的食品尤其容易氧化。由此产生的异味和氧化产物（如醛类和丙烯醛）不仅影响食品的储存稳定性，还可能对消费者健康产生不利影响。因此，准确评估脂质氧化程度一直被视为食品质量的重要指标。
过氧化值（POV）、硫代巴比妥酸反应物（TBARS）、对茴香胺值（p-AV）和共轭二烯值等常规方法已被用于评价脂质氧化。尽管这些方法相对简单且成本低，但通常只能提供特定官能团（如过氧化物或醛类）的总量，无法区分单一氧化产物。此外，在分析有色样品或复杂食品基质时可能出现干扰。为克服这些限制，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），包括高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）和超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS），已越来越多地用于表征脂质氧化产物。LC-MS/MS是液相色谱与串联质谱联用的总称，而高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UHPLC）则指色谱分离形式，UHPLC通常使用比常规HPLC更小的颗粒尺寸和更高的操作压力。质谱平台也应与色谱形式分开考虑。三重四极杆仪器常用于基于多反应监测/选择反应监测（MRM/SRM）的选择性靶向分析，而高分辨质谱（HRMS）平台如四极杆飞行时间（QTOF）和Orbitrap仪器则广泛用于精确质量分析、结构注释和非靶向脂质组学。因此，LC-MS/MS的分析特征取决于所用的色谱和质谱配置。在实践中，分析策略的选择取决于研究问题和目标氧化产物。常规氧化指标适用于快速评价整体氧化状态，而靶向LC-MS/MS更适用于选择性分析特定氧化产物。非靶向和伪靶向脂质组学提供更广泛的分子覆盖。GC/GC-MS仅在涉及挥发性氧化产物时提及。当同时需要整体氧化状态和分子水平信息时，联合策略可提供更全面的评价。表1总结了这些分析方法的主要特征和适用场景。
本综述总结了LC-MS/MS用于脂质氧化产物的分析原理和意义，全面讨论了基于脂质组学的方法及其在食品体系中的应用，范围涵盖研究充分的基质到较新的食品模型。此外，还讨论了部分动物研究，以将脂质氧化的解释从食品基质扩展到生物体系——在这些体系中，相关氧化脂质种类在不同基质和代谢条件下形成并被分析。还讨论了AI辅助方法在脂质组学数据分析中的应用。因此，本综述聚焦于基于LC-MS/MS的方法，仅在必要时提及基于GC的方法用于选择性挥发性氧化产物。
为更整合地解读这些研究，本综述通过四个相互关联的证据层面来考虑脂质氧化：(i) 氧化产物的化学形成与转化，(ii) 分析物稳定性与分析检测，(iii) 支持脂质鉴定的结构证据，以及(iv) 在食品和生物体系中的解释。这些层面相互关联，但不应视为等同：信号丰度的变化并不必然确立氧化产物的身份，结构鉴定本身也不能证明其形成机制。
2. 方法
本综述以叙述性综述方式开展，采用结构化文献检索。文献检索使用Google Scholar，主要侧重于2015年至2026年9月间发表的同行评审研究。检索词包括“lipid oxidation”、“oxidized lipid”、“hydroperoxide”、“oxylipin”、“HPLC-MS/MS”、“LC-MS/MS”、“lipidomics”、“food”、“animal model”和“machine learning”的组合。当早期里程碑式研究确立了仍在使用中的分析原理或方法时，也予以纳入。当研究提供了明确的分析条件、验证数据、机制信息或与脂质氧化直接相关的应用时，予以纳入或优先考虑。会议摘要、非英文文献、主要关注不相关污染物的研究以及缺乏与脂质氧化的明确分析或机制联系的研究，被排除在主要讨论之外。所选文献被归类为常规氧化指标、靶向LC-MS/MS分析、非靶向和伪靶向脂质组学、AI辅助脂质组学，并按氧化产物类别、样品基质和数据分析流程进一步分类。
3. 使用LC-MS/MS分析脂质氧化
3.1 分析前稳定性、反应性与方法验证
分析前处理和验证至关重要，因为样品制备可能改变表观氧化谱，尤其对不稳定的氢过氧化物和反应性醛类。在相关情况下应尽量降低热、光、氧和催化金属的暴露；当分析物和基质兼容时，提取和储存应在低温下进行。内标应尽早加入，当针对目标分析物经过验证时，应使用稳定化或衍生化处理。定量方法应评估校准性能、回收率、精密度、检出限/定量限、基质效应、残留效应以及分析物在提取、储存和自动进样器停留期间的稳定性。当存在显著基质效应时，应考虑基质匹配校准或标准加入法，并在有条件下优先使用同位素标记内标。这些分析前和验证因素应与结构鉴定水平一起报告，以便可靠地解释研究间的差异。
氢过氧化物分解和醛类反应性尤为重要，因为它们可改变采样与仪器分析之间的表观氧化谱。提取、储存或自动进样器停留期间氢过氧化物的损失可能低估初级氧化，而反应性醛类可能通过与蛋白质、氨基酸或其他亲核基质组分形成加合物而被消耗。相反，样品处理过程中的人工氧化可增加测量到的氧化产物。因此，验证应与分析前控制一起解释：校准和精密度表征仪器性能，而回收率、基质效应、分析物稳定性、残留效应和同位素标记内标决定所测浓度是否能充分代表原始样品。
3.2 氢过氧化物
脂质氢过氧化物（LOOHs）是不饱和脂肪酸双键相邻碳上的氢被自由基夺取后加氧而形成的初级氧化产物。根据氢过氧化物的形成方式，脂质氧化可分为自氧化、单线态氧介导的光氧化或脂氧合酶（LOX）介导的酶促氧化。不同的氢过氧化物异构体即使来自同一脂肪酸，也会根据氧化机制而生成。例如，亚油酸光氧化产生氢过氧十八碳二烯酸（HpODE）异构体，包括13-(9Z,11E)-HpODE以及9-、10-和12-HpODE，而自氧化主要产生13-(9Z,11E)-HpODE、13-(9E,11E)-HpODE、9-(10E,12Z)-HpODE和9-(10E,12E)-HpODE。因此，分析氢过氧化物异构体组成可用于追溯食品中发生的氧化途径，从而确定氧化原因。
氢过氧化物不仅是食品酸败的早期指标，也是随后分解为醛、酮等次级氧化产物的前体，从而导致风味劣变并形成可能对人体健康产生不利影响的氧化产物。传统上，氢过氧化物浓度通过POV定量，但该方法仅提供脂质氢过氧化物的总体度量，不能提供氧化机制信息。近年来，已开发了电喷雾电离（ESI）-LC-MS/MS方法，在正离子ESI模式下引入钠离子形成[M + Na]
+加合物离子。在串联质谱（MS/MS）碎裂时，氢过氧化物基团附近的键优先断裂产生特征碎片离子，从而区分9-、10-、12-和13-HpODE等异构体。此外，已建立了HPLC-ESI-MS/MS差示能量qualifier离子监测方法，即在MS/MS分析中施加多个碰撞能量，基于特征碎片离子区分并定量氢过氧化物、氢氧化物和酮。另外，使用C4反相色谱柱和选择反应监测的LC-MS/MS方法已被用于在低皮摩尔水平分离和定量脂肪酸氢过氧化物（FAOOHs）。基于LC-MS/MS的氢过氧化物分析为阐明食品中脂质氧化机制和制定抗氧化策略提供了重要信息。然而，氢过氧化物在提取和长时间自动进样器停留期间可能分解，而样品处理过程中添加抗氧化剂可能限制氧化。在Liang等人描述的FAOOH定量LC-MS/MS方法中，校准R
2为0.965–0.998，检出限（LODs）为0.1–1 pmol/μL，定量限（LOQs）为1–2.5 pmol/μL，回收率为48.1–76.0%，日内和日间变异系数（CVs）低于15%。不同FAOOH种类之间的基质效应存在差异，包括离子抑制和增强。FAOOH在样品处理前用2-甲氧基丙烯室温衍生化10分钟，然后进行碱水解，以提高氢过氧化物基团的稳定性，并在样品处理前加入脂肪酸（FA）19:1-OOH作为内标。据报道，FAOOH标准品即使在-30°C下长时间储存也不稳定，自动进样器长时间停留会增加降解的可能性。因此，可靠的氢过氧化物定量需要适当的校准和内标使用，同时评估回收率、基质效应、精密度以及分析物在提取、储存和LC-MS分析过程中的稳定性。
3.3 醛
醛是氢过氧化物形成烷氧自由基后经β-断裂生成的主要次级氧化产物，包括丙二醛（MDA）、4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）、4-羟基-2-己烯醛（4-HHE）、丙烯醛和己醛。其中，MDA和4-HNE对赖氨酸和组氨酸等氨基酸残基具有高反应活性，可诱导蛋白质加合物形成和交联。这些变化可改变蛋白质结构和功能，并影响食品品质。事实上，一项针对大豆来源肽的LC-ESI-MS/MS研究证实了MDA和4-HNE与氨基酸残基结合形成加合物。
TBARS已被广泛用于醛分析；然而，该测定对MDA的选择性较低，还可能与糖、氨基酸和其他羰基化合物反应，从而影响定量准确性。因此，没有色谱确认，TBARS不应被解释为特异性的MDA定量。相应地，已开发了用于醛定量的LC-MS/MS方法。例如，豆油和油炸食品中的醛在用2-肼基喹啉衍生化后通过液相色谱-质谱（LC-MS）检测和定量。这些醛不仅可用于评价食品氧化程度，还可用于阐明氧化过程中蛋白质与脂质之间的相互作用。然而，高反应活性的醛可能在样品制备过程中损失或与食品成分反应，导致低估。在一种用于油炸油和油炸食品中醛的LC-MS方法中，醛在60°C下用2-肼基喹啉衍生化30分钟，并使用丙酮-d6作为氘代同位素标记内标进行定量。另一种方法中，鱼油中的35种醛和酮在2,4-二硝基苯肼（2,4-DNPH）衍生化和固相萃取（SPE）净化后进行了分析。基质特异性验证也很重要；猪肉制品中4-HNE的HPLC-MS/MS分析显示线性范围为0.1–10 mg/kg，LOD为0.043 mg/kg，回收率约为60%，日内和日间精密度低于10%相对标准偏差（RSD）。因此，适当的衍生化、同位素标记内标和基质特异性回收率评价对可靠的醛定量非常重要。
3.4 醇
羟基脂肪酸（LOHs）是脂质氧化产物，当氢过氧化物发生均裂生成烷氧自由基随后获得氢而被还原，或氢过氧化物本身被还原时形成。部分羟基脂肪酸也会导致食品异味的形成。GC-MS在衍生化后也曾被使用；然而，LC-MS可在不衍生化的情况下分析完整脂质分子（如三酰甘油（TGs））中的羟基脂肪酸，从而提供甘油骨架信息。大气压化学电离（APCI）和ESI是常用的MS电离技术。特别是在APCI-MS分析中，TG甘油骨架上特定sn位置的脂酰键可能发生优先解离，产生sn位置依赖的碎片离子模式。测量这些碎片离子的强度比可提供甘油骨架上脂肪酸位置分布的定量信息。
作为下游脂质氧化产物，醇可提供仅从氢过氧化物或醛无法获得的氧化途径额外信息。羟基脂肪酸的位置模式也可作为氧化途径标记，因为不同氧化机制可产生特征性位置异构体。然而，由于许多羟基脂肪酸浓度较低，需要灵敏的检测和异构体分离。在一种经过验证的用于氢过氧二十二碳六烯酸（HpDoHE）和羟基二十二碳六烯酸（HDoHE）异构体的LC-MS/MS方法中，使用5(S)-羟基二十碳四烯酸-d8 [5(S)-HETE-d8]和12(S)-羟基二十碳四烯酸-d8 [12(S)-HETE-d8]作为同位素标记内标，并使用分析物与内标的峰面积比进行校准。HDoHEs的LOD为0.5–8.5 pg，r
2≥0.99，在脑中的平均回收率为84 ± 20%，血浆中为90 ± 13%。相比之下，HpDoHEs的回收率较低，分别为16 ± 22%和22 ± 14%，表明分析物稳定性和基质效应存在差异。大多数测试异构体的RSD低于8%，准确度高于90%。因此，可靠的羟基脂肪酸分析需要适当的内标校正、异构体特异性分离以及回收率和基质效应的评估。
3.5 酮、环氧和氧代脂质以及有机酸
酮是氢过氧化物分解过程中产生的次级氧化产物。烷氧自由基中间体的氧化或重排可生成含羰基产物，包括酮和氧代脂肪酸。环氧脂肪酸也在不饱和脂质氧化过程中形成，代表另一类含氧脂质氧化产物。环氧和氧代脂肪酸均可提供关于不饱和脂酰链氧化的额外信息。有机酸在脂质氧化的高级阶段形成，此时次级产物经历进一步氧化。这些产物可导致酸败和其他异味，从而影响食品的感官品质。
尽管GC-MS已被用于衍生化酮的分析，LC-MS方法也已直接或通过分析物特异性衍生化应用于酮和有机酸。基于LC-MS的方法还可用于环氧和氧代脂质分析，提供这些含氧脂质氧化产物的分子信息。C18反相色谱通常用于极性较小的分析物，而亲水作用液相色谱（HILIC）或其他极性分离可改善短链有机酸的保留。负离子模式ESI常用于去质子化有机酸。
这些氧化产物特别适用于研究与感官品质的关系，包括酸败和其他异味。然而，酮和有机酸的极性和分子量范围很宽，使用单一色谱条件难以同时分析所有化合物。因此，非靶向分析可提供对各种氧化产物（包括环氧和氧代脂质）的更广泛覆盖。例如，一种经过验证的用于六种有机酸的LC-MS方法显示R
2 > 0.991，LOQ为0.01 mM，标准品CV为2–11%，发酵培养基中回收率为95–105%。该研究还建议在提取后24小时内进行分析，因为较长的储存时间会增加分析变异性。
3.6 碳氢化合物
碳氢化合物是脂质氧化过程中烷氧自由基发生β-断裂时，由醛形成片段对面的碳链生成的次级氧化产物。代表性碳氢化合物包括戊烷和乙烷。戊烷已知在亚油酸等PUFA衍生的氢过氧化物分解时形成，而乙烷主要在n-3脂肪酸降解时产生。因此，氧化过程中形成的碳氢化合物类型可提供氧化起源脂肪酸的信息。
碳氢化合物相对不活泼且稳定，在体内不易被代谢；因此，一些研究提出它们比己醛等更易被代谢的醛类更适合作为体内指标。然而，低分子量碳氢化合物高度非极性且易挥发，缺乏易电离的官能团，使LC-MS/MS分析困难。因此，顶空GC/GC-MS被简要考虑作为挥发性碳氢化合物（如戊烷和乙烷）的替代方法。多环芳烃（PAHs）不是脂质氢过氧化物β-断裂直接形成的脂质氧化产物，因此本综述不再进一步讨论。
4. 脂质组学在脂质氧化分析中的应用
4.1 脂质组学简介
脂质组学是一种基于质谱（MS）的组学方法，表征样品内脂质的组成和丰度，以评估脂质组的整体变化。根据分析目标和数据采集策略，脂质组学可采用靶向、非靶向或伪靶向方法进行。脂质组学是代谢组学的一个分支，侧重于脂质种类的综合分析及其作为细胞膜结构组分、能量储存分子和信号介质的作用。脂质种类通常根据LIPID MAPS系统分为八大类：脂肪酰类、甘油酯类（GLs）、甘油磷脂类、鞘脂类、固醇脂类、异戊二烯醇脂类、糖脂类和聚酮类。ESI和APCI等软电离技术以及高分辨质谱（HRMS）和串联MS的最新进展，使得能够广泛检测具有不同极性的脂质类别及其单独分子种类，包括TGs、磷脂（PLs）、鞘脂和游离脂肪酸。
食品脂质主要由中性脂质（主要是TGs）、极性脂质（如PLs）和各种微量脂质组分组成。每个脂质类别包含多种分子种类，主要由其组成脂肪酸的链长和不饱和程度决定。脂质分子在发酵、焙烤、蒸煮等食品加工过程中会发生显著变化。基于MS的脂质组学因此被广泛用于检测食品掺假、监控质量控制和筛选加工引起的脂质种类结构变化。特别是在食品加工和储存过程中，氧化可导致含PUFA的TG减少，同时生成各种氧化脂质，包括氢过氧、羟基、环氧和氧代脂质。氧化也可能发生在脂肪酸链仍酯化在复合脂质内时，导致氧化磷脂（OxPLs）和氧化三酰甘油（OxTGs）。与游离次级氧化产物不同，OxPLs和OxTGs保留了原始脂质类别和氧化脂酰链的信息。基于LC-MS/MS的脂质组学因此可在分子水平上提供完整氧化脂质种类及其相应天然脂质变化的信息。这对于评价复杂食品和生物基质中的脂质氧化尤其有用。因此，同时分析天然脂质及其氧化衍生物对于理解脂质氧化过程非常重要。
基于LC-MS/MS的脂质组学通过色谱分离减少复杂脂质混合物的干扰，并提供保留时间和MS/MS碎裂信息，实现更高置信度的脂质鉴定。这种色谱联用策略还能在单次进样中分离不同脂质类别及其分子种类。此类方法已在单次分析中鉴定出复杂生物或食品基质中的一百多种单独脂质种类。然而，当缺少真实标准品时，脂质鉴定仍可能存在不确定性，分析结果也可能受到离子抑制、批次效应和数据库或软件依赖性注释的影响。因此，在解释脂质组学数据时应考虑这些局限。基于LC-MS/MS的脂质组学被广泛用于研究食品等复杂基质中氧化脂质的变化。该方法也已应用于动物模型，以表征饮食或处理引起的组织和血清脂质谱变化。随着脂质组学数据集在体量和复杂性上的增长，机器学习和其它基于AI的方法已被越来越多地用于识别脂质模式和生物标志物。
4.2 脂质组学的优势
靶向和非靶向方法具有不同的分析目标。靶向LC-MS/MS聚焦于预定义的氧化产物，如HpODE异构体、TGOOHs、PCOOHs、4-HNE和oxylipins，在具有化合物特异性标准品、校准和验证时适用于定量分析。相比之下，非靶向脂质组学提供更广泛的天然和氧化脂质种类谱图分析，通常使用HRMS，主要应用于发现与氧化相关的脂质变化。伪靶向脂质组学提供一种中间策略，即将非靶向分析中可重复的特征转化为预定义的多分析物小组。因此，这些方法是互补的，应根据分析目标进行选择。
脂质组学的另一个优势在于脂质种类数据可与多元统计分析集成。主成分分析（PCA）可用于可视化根据储存时间或处理条件引起的整体脂质谱变化，而偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）可识别对处理组间区分贡献显著的脂质种类。例如，核桃油在加速储存过程中的脂质组学分析显示TG、二酰甘油（DGs）和磷脂酰胆碱（PCs）显著减少，同时其他脂质类别发生变化，表征了氧化酸败随时间的进展。当进一步应用变量重要性投影（VIP）得分、统计显著性检验和相关性分析时，可选择与储存时间或氧化程度密切相关的生物标志物。因此，脂质组学不仅可用于表征脂质组成变化，还可用于识别指示氧化状态的氧化标记。
已鉴定的脂质种类可关联到京都基因与基因组百科全书（KEGG）和LIPID MAPS等数据库，以确定哪些脂质代谢通路（包括甘油酯代谢、甘油磷脂代谢和脂肪酸代谢）主要受影响。在同一核桃油储存研究中，KEGG通路分析确定甘油磷脂代谢是与氧化酸败相关的关键通路。此外，相关性或网络分析可用于评估脂质种类与其相关氧化或风味产物之间的关系，从而有助于识别潜在的脂质前体。在油炸油中，热加工植物油的相关性分析表明，氧化在富含自由基且短链脂肪酸含量低的不饱和TG中更为明显。
然而，通路数据库主要围绕生命系统中的酶催化反应构建，因此不能假定其代表食品氧化过程中发生的非酶自由基化学。KEGG富集结果如“甘油磷脂代谢”表明被归属于该生物通路的脂质发生了变化；它本身并不能证明氢过氧化物、醛、OxTG或OxPL形成的化学顺序。化学解释应考虑脂酰不饱和度、已知氢过氧化物分解途径、加氧模式、异构体分布以及前体和产物种类之间的相关性。因此，生物通路富集和化学氧化通路解释应作为不同证据层报告。例如，溶血磷脂的增加可能反映磷脂水解或脂质重塑，而非直接脂质氧化；而HETE种类可能同时通过酶介导的脂质代谢和非酶氧化产生。因此，LPC、HETE或其他氧化相关脂质的变化不应被解释为特定氧化或代谢通路的证据，除非有产物异构体、前体-产物关系、酶相关信息和补充氧化测量的额外支持。
4.3 鉴定置信度与注释水平
氧化脂质鉴定需要仔细解释，因为位置、几何和立体异构体可能具有相同的元素组成和相似的MS/MS谱图。仅凭精确质量不足以完成结构鉴定。保留时间和诊断性MS/MS碎片离子可提高鉴定置信度，而脂酰组成、sn位置、双键位置或氧化位置的归属需要相应的结构证据。因此，氧化脂质应仅以分析数据支持的结构水平进行注释。当特定结构特征无法分辨时，不应将该脂质报告为完全鉴定的分子种类。与真实标准品比较以及额外的色谱或MS/MS证据可进一步提高鉴定置信度。
4.4 氧化磷脂和氧化三酰甘油
氧化磷脂（OxPLs）和氧化三酰甘油（OxTGs）是完整的复合脂质，其中氧化发生在易感脂酰链仍与磷脂或甘油骨架酯化时。与游离脂肪酸氧化产物或低分子量次级产物不同，这些种类保留了母体脂质类别和氧化脂酰基团的信息。OxPLs与富含膜和界面的体系尤其相关，而OxTGs在中性脂质丰富的基质中很重要，如食用油和脂滴。
对于食品体系，TGOOH和PCOOH异构体分析已证明完整氧化脂质可提供仅靠总体指标无法获得的机制信息。TGOOH异构体分布已被用于区分食用油和牛奶中的自由基和单线态氧介导的氧化，而PCOOH异构体已被用于检查蛋黄酱中的磷脂氧化。非靶向氧化脂质组学可将这种覆盖扩展到更广泛的OxTG和OxPL谱图，尽管随着可能的氧化位点和异构体数量增加，可靠归属变得更加困难。
在生物体系中，OxPLs和其他氧化复合脂质可在酶促和非酶促氧化条件下在膜和脂蛋白中产生，并可能参与信号传导或疾病相关过程。因此，LC-MS/MS检测到的氧化复合脂质不应仅根据精确质量来解释。保留行为、诊断性MS/MS碎片、氧化位点证据以及在可用时的真实标准品都需支持所报告的结构水平。定量还受到化合物特异性标准品稀缺以及类别和种类依赖性电离和基质效应的限制。这些问题使得OxPLs和OxTGs成为为什么必须同时评估氧化化学、鉴定置信度和生物学解释的重要例证。
4.5 脂质组学在含脂食品中的范围与适用性
在食品研究中，脂质组学通过识别加工和储存过程中单个脂质种类的变化来评价脂质稳定性和氧化特性。由于食品脂质组成随原料和加工条件显著变化，确定同一脂质类别中含特定脂肪酸的哪些脂质种类选择性升高或降低非常重要。因此，研究通常比较处理前后或储存期间TG、DG、PC、磷脂酰乙醇胺（PE）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）和其他脂质类别的相对丰度。
在脂质稳定性研究中，不仅考虑脂质类别的丰度，还可考虑单个脂质种类的脂酰组成来评估变化。含PUFA的TG和PL在储存和加工过程中可能选择性减少，且变化程度随不饱和程度而不同。
脂质谱随时间的变化在氧化分析中也很重要。一项研究冷藏储存期间脂质组变化，发现GL和PL组成随储存时间持续变化，从而可区分不同阶段的质量劣变。
脂质组学也已应用于表征食品加工方法引起的脂质变化。在喷雾干燥蛋黄中，定量LC-MS/MS脂质组学被用于比较加工前后单个脂质种类，揭示特定PL和GL的变化。在热加工食品中，还比较了加热前后的脂质谱，以区分热敏感和相对稳定的脂质种类，并从脂质氧化的角度解释这些变化。此类研究表明，可通过将不同加工条件应用于同一原料来评价脂质稳定性。然而，检测到的氧化产物及其分析相关性可能随脂质组成和食品基质的物理组织而不同。因此，基于LC-MS/MS的脂质组学应根据基质特异性特征进行解释，而不是在不同食品体系中采用相同的分析目标。不同食品基质的主要脂质特征、脂质组学变化和应用总结于表2。
5. 不同食品模型中的脂质氧化分析
氧化的速率和机制随食品的物理化学结构而有显著差异，包括脂质是否被PL层等膜包围以及是否存在于乳液中。因此，基于LC-MS/MS的分析方法不仅被广泛应用于食用油，还应用于肉制品、乳液，以及较新的油体。食用油和肉制品被选为脂质氧化研究中已充分建立的食品模型。乳液被选为代表界面脂质体系，而油体被选为近年来受到越来越多关注的自然结构化脂滴。因此，这些模型代表不同的脂质组织和研究应用，而非所有富含脂质的食品。以下章节描述了基于LC-MS/MS的脂质氧化分析如何应用于这些不同的食品模型。
5.1 食用油
食用油主要由TG组成，氧化产生三酰甘油氢过氧化物（TGOOHs）作为主要初级氧化产物，其中氢过氧化物基团形成在酯化于TG的脂肪酸链上。与其他食品模型相比，食用油中蛋白质或碳水化合物的基质干扰相对较少，因此这些体系中的氧化脂质已被广泛通过LC-MS/MS分析。
在靶向分析中，大豆油、米糠油和橄榄油中的亚油酸氢过氧化物（HpODE）异构体通过手性LC-MS/MS分离，表明不同食用油中可能存在不同的氧化机制。菜籽油中的TGOOH异构体也被直接通过LC-MS/MS分析，以评估TG氧化中涉及的自由基和单线态氧介导机制。该方法随后被应用于特级初榨橄榄油，识别了热氧化和光氧化产生的TGOOH异构体比差异。此外，商业鱼油产品中的35种醛和酮在2,4-二硝基苯肼（2,4-DNPH）衍生化和固相萃取（SPE）净化后通过LC-MS/MS同时定量，提供了产品氧化稳定性的信息。
脂质组学也被用于研究食用油氧化过程中的脂质组成整体变化。在亚麻籽油中，使用基于超高效液相色谱（UPLC）-Q Exactive Orbitrap MS的脂质组学分析了焙烤前后GL、PL和其他脂质种类的变化。类似地，UPLC-QTOF-MS脂质组学被应用于加速储存过程中的榛子油，以表征TG、DG、PC和PE种类的变化。与非靶向脂质组学相比，直接分析HpODE或TGOOH异构体可提供更特异的氧化途径信息，但仅限于预定义化合物且需要适当的标准品。相反，非靶向脂质组学提供更广泛的天然和氧化脂质种类变化覆盖，尽管脂质注释和定量解释可能更受限。因此，这些方法在特定氧化产物和更广泛的脂质组变化方面提供互补信息。
5.2 肉制品
肉制品在肌肉和脂肪组织中含有PL和TG，同时存在强促氧化因子，特别是来自肌红蛋白的血红素铁。血红素铁可促进脂质氧化，尤其是在富含PUFA的膜PL中。氧化过程中产生的醛可与肌肉蛋白中的氨基酸残基反应，改变蛋白质结构和功能，从而导致品质劣变。因此，肌肉食品中脂质和蛋白质氧化可同时发生，反应性脂质衍生醛也可能与蛋白质氧化相关。
肉制品的样品制备也需要考虑复杂的肌肉基质。例如，为生物体液中的4-HNE分析开发的方法在应用于肉类样品时显示出不佳的回收率和重复性，因此开发了一种使用SPE净化和HPLC-MS/MS的肉类专用方法。在靶向分析中，使用该方法对猪肉和加工猪肉产品中的4-HNE进行了定量，观察到产品依赖性的4-HNE形成差异。该方法的LOD为0.043 mg/kg，回收率约为60%，线性范围为0.1–10 mg/kg，日内和日间精密度低于10%相对标准偏差（RSD），证明了肉类分析中基质特异性样品制备和验证的重要性。
近年来，脂质组学越来越多地被用于表征肉制品中脂质类别的广泛变化。在黄羽鸡中，使用UPLC-ESI-MS脂质组学研究热加工过程中TG、DG、PL和其他脂质种类的变化。研究报道一些不饱和PL减少和溶血磷脂增加，主要归因于PL水解。因此，这些变化应谨慎解释，因为它们可能反映加工相关的脂质重塑，而非直接脂质氧化的证据。在预煮中式炖牛肉中，使用UPLC-ESI-MS/MS脂质组学鉴定与过热味（WOF）相关的脂质前体，并展示其变化、脂质氧化和异味形成之间的关系。因此，在肉制品体系中，靶向分析可定量特定氧化产物的变化，而脂质组学可同时表征参与氧化的脂质前体和脂质组的更广泛改变。
5.3 乳液
乳液是由乳化剂稳定油和水的食品体系，根据连续相和分散相分为水包油（O/W）型（油分散于水）或油包水（W/O）型（水分散于油）。O/W乳液具有较大的油-水界面面积，促进脂质与水相中金属离子或氧化催化剂之间的相互作用；因此，其氧化行为可能不同于整体油。O/W乳液中的脂质氧化主要发生在油-水界面或附近，不饱和脂质可与水相中的过渡金属和其他促氧化剂相互作用。乳化剂的类型和性质可影响界面电荷和金属结合，从而影响金属催化的脂质氧化。因此，含有相同油的乳液可能因界面组成不同而表现出不同的氧化行为。
在基于菜籽油的婴儿配方奶粉和添加二十二碳六烯酸（DHA）乙酯的婴儿配方奶粉中，基于UPLC-MS/MS的游离oxylipins靶向分析揭示了DHA补充对氧化脂肪酸形成的影响。在随后的冷藏储存研究中，对游离和酯化oxylipins均进行了定量，显示oxylipin水平随储存时间变化，DHA补充影响某些氧化产物的形成。
在蛋黄酱中，提取总脂质，使用氨基丙基SPE分离PL级分，所得级分通过HPLC-MS/MS分析。磷脂酰胆碱氢过氧化物（PCOOH）异构体组成分析表明，蛋黄酱中的PL氧化主要由自由基氧化而非单线态氧引发。在牛奶中，LC-MS/MS定量TGOOH异构体同样已被用于阐明乳脂的氧化途径。
奶酪是一种复杂的蛋白质凝胶基质，含有源自原始乳乳液的分散脂肪球。在辐照卡门贝尔奶酪中，使用UHPLC-Q-Orbitrap-MS脂质组学表征氧化脂质，包括氧化三酰甘油（OxTG）和氧化二酰甘油（OxDG）种类，并鉴定响应辐照而变化的脂质种类。因此，基于LC-MS/MS的脂质氧化分析继续被积极应用于乳液和乳制品。
5.4 油体
油体是植物种子中发现的脂质储存细胞器。其核心由TG组成，并被含有油体蛋白（如oleosins）的PL单层包围。本综述中，油体主要被视为用于评价脂质氧化和氧化稳定性的自然组织化食品脂质结构。分离的油体也可用作食品配料或亲脂性化合物的递送系统。
油体的氧化稳定性不仅受其内部TG脂肪酸组成的影响，还受酚类化合物和储存蛋白的影响。在菜籽油体储存研究中，油体O/W乳液中TG的氢过氧化物形成比整体油和卵磷脂稳定的O/W乳液对照更慢，表明油体结构内TG具有相对更高的氧化稳定性。在向日葵油体中，酚含量较高条件下TG氧化被抑制，储存蛋白含量较高时脂质氧化速率也降低。
研究还结合脂质氧化评估了油体结构变化。在山核桃储存期间，油体结构破坏增加了内部脂质与氧的接触并促进氧化，证明了油体结构稳定性与氧化稳定性之间的关联。另一项研究中，使用UPLC-Q Exactive MS脂质组学表征山核桃储存引起的各种脂质种类变化，包括GL、PL和氧化磷脂（OxPL）种类，并研究储存期间的水解和氧化。
基于LC-MS/MS的脂质组学也已应用于表征构成油体的单个脂质种类。在米糠来源的油体中，使用超高效液相色谱（UHPLC）-Q-Exactive Orbitrap MS脂质组学表征脂质组成，包括PL和GL，证明油体界面的脂质种类组成与氧化稳定性密切相关。
目前油体氧化的研究主要集中在基于氢过氧化物的氧化指标和界面结构变化，而对油体中单个OxTG和OxPL种类的直接研究仍相对有限。未来的LC-MS/MS脂质组学研究可能有助于阐明天然和分离体系中油体的氧化。
6. 脂质组学在动物模型脂质氧化分析中的应用
食品中分析的脂质氧化产物也与生物体系相关，在这些体系中，相关氧化脂质种类可通过酶促和非酶促氧化产生。基于LC-MS/MS的脂质组学因此已被应用于表征氧化应激和疾病条件下血浆和组织中的这些产物。选择部分动物研究是为了将上述食品氧化分析框架扩展到生物体系，同时考虑到氧化脂质的形成和命运也可能受酶促过程和组织特异性代谢的影响。
6.1 氧化应激和疾病相关脂质氧化
动物模型很有用，因为氧化应激可以进行实验控制，并且可以比较不同组织中的氧化脂质。在一项研究中，在小鼠中用阿霉素或叔丁基氢过氧化物诱导氧化应激后，通过LC-MS/MS定量了血浆中花生四烯酸衍生的异前列腺素异构体。氧化应激下异前列腺素水平增加，证明LC-MS/MS可用于定量生物样品中的特定氧化产物。
低密度脂蛋白（LDL）氧化过程中产生的氧化脂质也已通过MS分析。由于LDL包含多种脂质类别，包括胆固醇酯（CEs）、TGs和PLs，氧化过程中可生成多种氧化脂质。对最小氧化LDL（mmLDL）进行了LC-MS分析，鉴定了氧化CEs，包括胆固醇酯氢过氧化物（CEOOHs）。另一项研究还在载脂蛋白E（ApoE）缺陷小鼠的动脉粥样硬化病变中检测到氧化CEs。
疾病相关脂质氧化也在其他组织中进行了研究。在非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中，使用基于LC-MS的脂质组学分析肝脏和肾脏中的脂质及脂质氢过氧化物，鉴定了疾病相关脂质种类，包括来源于TG和PC的氢过氧化物。在大鼠骨关节炎模型中，通过LC-MS/MS分析了多个组织中的oxylipins和内源性大麻素。观察到组织依赖性变化，包括膝关节中12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）和背根神经节中15-HETE的增加。
由于这些研究比较不同组织和实验条件下的氧化脂质，分析前处理对于可靠解释也很重要。氧化脂质，特别是氢过氧化物，在组织采集和提取过程中可能不稳定。采集后快速冷却或冷冻、限制光和氧暴露、低温提取以及尽早加入适当内标有助于减少取样后的变化。
6.2 饮食相关脂质变化和膳食氧化脂质
除内源性和疾病相关脂质氧化外，脂质组学也被应用于表征饮食诱导的脂质变化。在高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗小鼠中，基于LC-MS/MS的脂质组学揭示了心脏组织中包括TG在内的多种脂质种类的变化。激光解吸/电离质谱（LDI-MS）也被用于确定组织切片中这些脂质变化的空间分布。
然而，饮食诱导的组织脂质组成变化应与直接摄入食品中氧化脂质的生物学效应区分开来。食品来源的氧化脂质经过消化、吸收和代谢，因此需要特定的膳食暴露研究。这一区别在将食品脂质氧化与生物体系中观察到的变化相关联时非常重要。
7. AI辅助脂质组学分析与应用
基于LC-MS/MS的非靶向脂质组学可在单次分析中产生数百至数千个脂质特征，使得从峰检测、对齐到鉴定和主要脂质种类选择的数据处理耗时且费力。此处，特征是指以特定m/z和保留时间为特征的单个LC-MS信号。为了更快、更准确地处理这些数据，包括机器学习（ML）和深度学习在内的AI方法已应用于脂质组学分析的多个阶段。这些应用可根据分析流程进行考虑，包括脂质鉴定和保留时间预测、氧化脂质谱分析和生物标志物选择，以及模型验证和解释。
7.1 脂质鉴定和保留时间预测
在脂质鉴定阶段，已开发了ML模型通过学习中MS/MS产生的碎片离子模式来预测脂质类别。一个代表性例子是MS2Lipid，它使用人工整理的MS/MS光谱开发，用于分类脂质亚类，在测试数据集上达到了97.4%的准确率。与基于特定碎片离子存在与否的常规脂质鉴定方法不同，MS2Lipid学习积累的MS/MS光谱模式来预测脂质类别。这种方法可在诊断碎片离子不清晰或相似碎片出现在多个脂质类别中时促进脂质分类。
ML也被应用于预测HPLC中脂质的保留时间。研究使用分子描述符（数值化表示脂质结构性质，如分子量、碳数、双键数和极性）训练ML模型，以预测单个脂质的保留时间。在非靶向脂质组学中，多个脂质候选物可能具有相同或相似的m/z值。在这种情况下，将根据结构性质预测的保留时间与实验测量值进行比较，有助于缩小候选列表并提高脂质鉴定置信度。然而，这些预测应作为支持信息，而非替代诊断性MS/MS或真实标准品。
7.2 氧化脂质谱分析和生物标志物选择
近年来，基于AI的方法也被应用于氧化脂质的LC-MS/MS分析。一项研究通过将基于ML的保留时间预测模型与氧化脂质鉴定软件LPPtiger 2相结合，开发了用于OxPL分析的LC-MS工作流程。简言之，使用在PL结构与保留时间关系上训练的模型预测脂质保留时间，然后利用预测结果构建候选OxPL库。
ML还可用于从LC-MS/MS获得的氧化脂质数据集中选择主要脂质种类。在一项针对脓毒症相关急性肾损伤患者血浆的研究中，通过UPLC-MS/MS分析氧化脂质，随后使用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）和随机森林（RF）算法从大量检测到的脂质中选择与患者状态相关的关键脂质种类。LASSO和RF是选择对组间区分贡献较强的变量的方法，类似方法可用于识别在LC-MS/MS检测到的脂质中最能解释氧化状态的脂质种类。然而，这些模型选择的脂质特征需要进一步的分析鉴定和独立验证，才能作为可靠的生物标志物使用。
7.3 模型验证与解释
基于AI的脂质组学性能在很大程度上取决于训练数据的数量和质量，数据集不足或有偏差可能导致错误预测。由于脂质组学数据集通常包含相对于样本数量大量的特征，当模型拟合训练数据但在独立数据上表现不佳时，可能发生过拟合。小型或不平衡数据集以及从有限样品类型或分析条件获得的训练数据也可能引入模型偏差。
数据泄漏是另一个重要问题，因为测试样本的信息可能在预处理或特征选择期间被无意使用，导致模型性能被高估。因此，预处理和特征选择应在训练和测试数据集之间分开进行。交叉验证对内部模型评估有用，而独立测试数据和外部验证需要更可靠地评估模型性能。
当模型应用于来自不同分析批次、仪器或实验室的数据时，外部验证也很重要。保留时间、电离条件、MS采集和数据处理方面的差异可降低模型的可转移性，因此在将模型应用于新数据集时应考虑这些因素。
此外，深度学习等复杂模型可能存在黑盒问题，难以确定哪些脂质或MS信号对预测有贡献。为解决这一问题，近期已应用可解释AI方法，如SHapley Additive exPlanations（SHAP），其可量化单个特征对模型预测的贡献。然而，特征在AI模型中的重要性并不确认其化学身份或生物学意义。因此，AI识别的主要脂质特征也应通过适当的脂质注释和分析证据进行评估。
为保证可复现性，研究应清楚报告主要预处理和特征选择程序、训练和测试集划分、验证策略和模型参数。图3总结了AI辅助应用在脂质组学工作流程中的代表性案例。
因此，在单个数据集内通过内部交叉验证获得的高分类准确率不应被解释为可泛化性能的证据。数据泄漏可能夸大表观准确率，当脂质特征数量远超过样本数量时容易发生过拟合，并且可能学习到仪器或批次特异性信号模式而非化学上有意义的特征。稳健的AI辅助脂质组学因此要求训练和测试预处理的分离、在特征选择时进行适当嵌套或独立验证，以及当预期应用超出原始数据集时，在批次、仪器、实验室或样本群体间进行外部评估。
8. 结论
脂质氧化分析应根据研究目标选择互补的分析方法。常规氧化指标提供整体氧化状态的信息，而基于MS的方法能够更特异或更广泛地表征单个氧化产物和脂质种类。没有任何单一分析方法能够完全表征脂质氧化的复杂进程。
可靠的脂质氧化解释不仅需要考虑仪器分析，还需要考虑样品处理、基质效应、分析物稳定性和脂质鉴定置信度。氢过氧化物和反应性醛在提取和储存期间可能发生变化，而食品结构和脂质组织的差异可影响氧化行为。因此，适当的内标、回收率和基质效应的验证以及来自MS/MS或真实标准品的结构证据对于提高分析可靠性非常重要。
未来研究应侧重于氧化复合脂质的分子表征，包括OxPLs和OxTGs，以及仍较少被表征的环氧和氧代脂质。需要更大程度地标准化样品制备、分析验证和脂质注释，以提高研究间的可比性。此外，将靶向和非靶向脂质组学与常规氧化指标及食品结构信息相结合，可提供对脂质氧化更全面的理解。AI辅助脂质组学可能进一步支持脂质鉴定和生物标志物选择；然而，外部验证、可复现性和跨分析平台的可转移性仍是其更广泛应用的重要优先事项。
