预康复作为调控胰腺癌肿瘤微环境的一种策略：一项基于成像质谱流式技术的探索性初步分析

《International Journal of Molecular Sciences》：Prehabilitation as a Strategy to Modulate the Tumor Microenvironment in Pancreatic Cancer

　　

多模式预康复旨在通过运动、营养和心理优化增强对癌症治疗的耐受性。虽然预康复可改善身体状况和功能状态，但其对肿瘤微环境的生物学影响仍鲜有表征。在胰腺导管腺癌中，肿瘤微环境以免疫抑制和促结缔组织增生特征为主，限制了免疫细胞浸润和治疗效果。作为一项探索性初步分析，本研究描述了接受手术切除前进行预康复与未进行预康复的患者胰腺肿瘤微环境中细胞组成、空间关系和功能信号的差异。研究人员采用包含34种蛋白的检测面板，利用成像质谱流式技术分析了八例患者（四例预康复，四例对照）的肿瘤样本，在单细胞分辨率下对肿瘤-免疫景观及功能状态进行了分类。预康复组肿瘤显示出较低的中性粒细胞和上皮/肿瘤细胞密度，以及自然杀伤细胞、CD4+和CD8+ T细胞的富集。空间分析揭示预康复组肿瘤呈现免疫许可性结构，而对照组则为免疫抵抗性模式。功能标志物分析显示，预康复组免疫抑制性群体中的激活和促肿瘤信号减弱，包括调节性T细胞中HLADR、pAkt、pNFκB的表达降低，以及胶原蛋白阳性的肿瘤相关成纤维细胞中NOS2、pERK、pNFκB、pSTAT3的表达降低。这些初步发现提出了预康复可能与胰腺导管腺癌中免疫许可性肿瘤微环境相关的可能性，支持在更大规模的前瞻性设计队列中进一步研究其免疫调节潜力。

研究背景与目的

胰腺癌是一种预后极差的致死性疾病，其中最常见的组织学亚型——胰腺导管腺癌占胰腺恶性肿瘤的90%以上。由于早期症状隐匿且缺乏有效的筛查工具，大多数患者在确诊时已处于晚期或转移阶段，仅有不到20%的患者在诊断时有资格接受手术切除这一唯一可能根治的治疗手段。即便完成了所有既定肿瘤治疗方案，总生存率仍然很低。胰腺导管腺癌的肿瘤微环境以其独特的致密性著称，表现为广泛的细胞外基质沉积、密集的促结缔组织增生性间质以及大量免疫抑制性细胞的存在，如肿瘤相关中性粒细胞、髓源性抑制细胞和调节性T细胞。这种免疫排斥性微环境限制了细胞毒性T细胞物理上和生化上对恶性细胞的接触，是治疗抵抗的核心原因。近年来，预康复作为一种整合了运动、营养优化和心理支持的个体化干预措施，已被证明能改善多种癌症患者的术后恢复和生活质量，甚至提高长期生存率。然而，关于预康复是否能直接影响肿瘤生物学，特别是重塑肿瘤微环境，目前的证据非常有限，大部分机制见解来源于临床前模型。因此，本研究旨在通过一项探索性初步分析，比较接受正式预康复计划与未接受该计划的胰腺导管腺癌患者在肿瘤微环境细胞组成、空间结构和功能信号方面的差异，以探究预康复潜在的免疫调节益处。

研究方法与技术

研究人员从休斯顿卫理公会医院获取了2019至2024年间行胰腺切除术的八例经组织学确诊的胰腺导管腺癌患者的切除标本，其中四例接受了多模式预康复计划，四例为匹配的对照组。研究采用了成像质谱流式技术，应用包含34种金属标记抗体的检测面板对肿瘤切片进行染色和采集。数据处理方面，利用ilastik和CellProfiler进行单细胞分割，通过HistoCAT提取单个细胞的平均标记强度，并在RStudio中使用Seurat包的Louvain算法进行无监督聚类，最终将细胞簇注释为十五类经典的免疫、基质和肿瘤细胞。空间分析通过HistoCAT的邻域分析评估不同细胞类型间的邻近关系，并使用Cochran-Armitage趋势检验进行比较。功能标志物分析则关注免疫活化、肿瘤驱动炎症和基质重塑相关的蛋白表达水平。

研究结果

2.1 细胞组成

成像质谱流式技术识别出代表上皮、免疫和基质群体的十五个细胞簇。按感兴趣区域面积归一化后，预康复组肿瘤相较于非预康复组，其中性粒细胞和上皮/肿瘤细胞平均密度呈下降趋势，而自然杀伤细胞、CD4⁺常规T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞的密度呈上升趋势。二维t分布随机邻域嵌入图显示所有样本中上皮、淋巴系、髓系和基质区室均呈现一致的分离。

2.2 空间邻域分析

空间邻域分析揭示了组间不同的细胞-细胞邻近模式。在非预康复组中，肿瘤/上皮细胞与中性粒细胞及胶原蛋白产生型成纤维细胞表现出负向空间富集，即空间关联减少。相反，在预康复组肿瘤中，肿瘤/上皮细胞与自然杀伤细胞、CD8⁺ T细胞和内皮细胞表现出正向空间富集。尽管由于样本量小，错误发现率校正后的显著性未能保持，但精确留一法置换检验识别出若干稳健的信号，尤其是肿瘤/上皮细胞与内皮细胞和CD8⁺ T细胞邻近性的增加。

2.3 成像质谱流式验证

成像质谱流式可视化图像显示，非预康复组中上皮或肿瘤细胞区域较大且连续，周围基质富含α-平滑肌肌动蛋白阳性成纤维细胞和CD15⁺、CD68⁺髓系细胞，CD8⁺淋巴细胞主要位于肿瘤-基质交界处。而在预康复组中，上皮或肿瘤细胞区域显得更小、更破碎，其间穿插着免疫细胞群体，CD8⁺淋巴细胞同时存在于基质和上皮区域，CD15⁺和CD68⁺细胞围绕上皮结构的排列不如非预康复组紧密。

2.4 功能标志物表达

功能标志物分析显示预康复组的炎症性和促肿瘤信号通路持续减弱。调节性T细胞中HLADR、pAkt和pNFκB的表达低于对照组。胶原蛋白阳性成纤维细胞中NOS2、pERK、pNFκB和pSTAT3的表达也降低。组间统计检验显示，预康复组肿瘤中NOS2、pERK、pNFκB和pSTAT3的表达显著低于对照组，这些发现在多个感兴趣区域中可重复，与炎症活化减弱和更具抑制性的基质表型一致。

讨论与结论

讨论部分指出，这项探索性初步研究的结果表明，接受预康复的胰腺导管腺癌患者肿瘤微环境呈现出较低的肿瘤细胞密度、较少的中性粒细胞、较高的自然杀伤细胞和T细胞密度，以及免疫细胞与上皮细胞间更丰富的空间相互作用，同时调节性T细胞和胶原蛋白产生型基质细胞的功能活化标志物表达降低。这些模式提示预康复可能与一种更有利于免疫的肿瘤微环境相关联。研究人员讨论了这些发现与现有知识的契合度，指出胰腺导管腺癌中细胞毒性淋巴细胞与上皮细胞的邻近性与更好的预后相关，而预康复组观察到的空间模式可能反映了向更有利免疫表型的转变。研究还探讨了预康复可能的潜在机制，如有氧运动可通过IL-6和IL-15途径动员自然杀伤细胞和CD8⁺ T细胞，营养干预可降低全身炎症，心理干预可减轻交感神经信号和糖皮质激素介导的免疫抑制。研究的局限性包括样本量极小、回顾性设计导致的混杂因素、以及缺乏临床终点的评估。

研究结论：在这项探索性初步分析中，胰十二指肠切除术前的多模式预康复与胰腺肿瘤微环境中免疫组成的差异相关。预康复组肿瘤倾向于表现出更低的上皮和肿瘤细胞密度、较低的中性粒细胞比例、自然杀伤细胞、CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体的富集，以及指向更强免疫与上皮邻近性的空间模式。功能谱分析显示炎症和基质信号通路的活化降低，包括pNFκB、pSTAT3、pERK和NOS2，这可能提示肿瘤驱动的炎症减弱和成纤维细胞介导的免疫排斥减少。尽管是初步结果，这些发现支持了全身生理调理可能除了改善功能储备外，还能影响瘤内生物学的概念。如果在更大的前瞻性队列中得到验证，预康复可能代表一种非药物策略，能够增强免疫监视、促进更允许性的肿瘤结构，并提高胰腺导管腺癌对细胞毒性或免疫疗法的反应性。