rLci5与rKDDR重组抗原：人内脏利什曼病血清学诊断的高潜力工具

《Acta Tropica》：rLci5 and rKDDR: recombinant antigens with high diagnostic potential for human visceral leishmaniasis

利什曼病属于世界卫生组织列出的被忽视热带病（neglected tropical diseases, NTDs）之一，发生于98个国家，且多数病例集中在印度、苏丹和巴西等流行区。在美洲，由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的人内脏利什曼病（human visceral leishmaniasis, HVL）因其严重的临床病程尤为突出，其特征为持续发热、肝脾肿大、贫血、进行性体重减轻，以及未治疗时的高致死率。研究人员评估了重组抗原rLci5和rKDDR-plus通过间接ELISA检测人L. infantum感染抗体的诊断准确性，并与其国内现行推荐方案进行比较。研究人员使用了经确认的HVL阳性（59例）和阴性（81例）人血清样本，以及恰加斯病（65例）和皮肤利什曼病（20例）等其他感染血清样本。rKDDR-plus间接ELISA的敏感性为98.3%（95% CI：91.0–99.9%），特异性为98.8%（95% CI：93.3–99.9%），AUC为99.8%（95% CI：99.5–100%）；rLci5间接ELISA的敏感性为91.5%（95% CI：81.6–96.3%），特异性为97.5%（95% CI：91.1–99.6%），AUC为97.4%（95% CI：95.0–99.8%）。使用辣根过氧化物酶标记的蛋白A（Protein A）替代传统 conjugated antibody 并未显著改变诊断性能，同时提高了阳性样本的光密度值。与巴西卫生部推荐的rK39快速检测相比，两种重组抗原ELISA均表现出相当的敏感性，而rKDDR-plus ELISA在特异性方面更具优势。研究结果表明，rLci5和rKDDR-plus可作为HVL血清学诊断的可靠工具，并支持将Protein A作为多宿主应用场景中种属特异性conjugated antibody的可行替代方案。

内脏利什曼病是由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的致命性人兽共患寄生虫病，其临床特征包括长期发热、肝脾肿大、贫血和进行性消瘦，未治疗时致死率高。目前巴西卫生部推荐采用基于rK39的免疫层析快速检测作为人内脏利什曼病（human visceral leishmaniasis, HVL）的一线血清学诊断方案，但该检测在部分人群中敏感性偏低，尤其在低龄儿童和HIV共感染者中表现不佳，且与克氏锥虫等其他锥虫科感染存在交叉反应，影响其鉴别诊断能力。为克服rK39的局限，研究人员评估了重组抗原rLci5和rKDDR-plus在间接ELISA中检测人抗L. infantum IgG抗体的诊断性能，并与现行快速检测进行比较。研究人员利用包含225例血清样本的队列（59例确诊HVL阳性、81例健康对照、65例恰加斯病、20例皮肤利什曼病）对两种抗原进行了系统评估。结果显示，rKDDR-plus ELISA的敏感性达98.3%（95% CI：91.0–99.9%）、特异性为98.8%（95% CI：93.3–99.9%），AUC为99.8%；rLci5 ELISA的敏感性为91.5%（95% CI：81.6–96.3%）、特异性为97.5%（95% CI：91.1–99.6%），AUC为97.4%。将检测试剂替换为辣根过氧化物酶标记的蛋白A（Protein A）后，两种ELISA仍保持较高的诊断效能，且阳性样本光密度值进一步提升。与rK39快速检测相比，两种重组抗原ELISA的敏感性与之相当，而rKDDR-plus在特异性上更优。本研究为rLci5和rKDDR-plus作为下一代HVL血清学诊断候选抗原提供了有力证据。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用此前已构建并验证的重组蛋白rLci5（Borja et al., 2018）和rKDDR-plus（Siqueira et al., 2021）作为包被抗原；以人血清样本为检测对象，通过方阵滴定法（checkerboard titration）优化抗原包被浓度、血清稀释度和酶标二抗或蛋白A（Protein A）稀释度，建立间接ELISA体系；以巴西卫生部推荐的rK39快速检测（LSH Ab ECO Teste, ECO Diagnóstica SD Biosensor?）作为平行对照；采用受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线确定cut-off值和曲线下面积（area under the curve, AUC）；运用McNemar检验比较不同检测方法的差异，并以Cohen's kappa系数（κ）评价检测方法间的一致性。样本来源于巴西北部州塞尔希培（Sergipe，HVL阳性和阴性血清）和巴伊亚（Bahia，恰加斯病和皮肤利什曼病血清），所有样本均储存于Fiocruz Bahia的LAIPHE血清库。

3.1 rLci5间接ELISA的标准化
通过方阵滴定法，rLci5 ELISA的最佳条件为抗原50 ng/孔、血清稀释1:50、酶标抗人IgG抗体稀释1:40,000。采用蛋白A优化时，最佳稀释度为1:20,000，该条件下阳性与阴性样本的光密度（optical density, OD）均值差最大（Δ=1.28），表明判别能力最优。

3.2 rLci5与rKDDR-plus间接ELISA的性能评估
以225例血清样本（59例HVL阳性、81例健康对照、65例恰加斯病、20例皮肤利什曼病）为检测对象，rLci5 ELISA正确识别54/59例阳性（敏感性91.5%，95% CI：81.6–96.3%）和79/81例健康阴性（特异性97.5%，95% CI：91.1–99.6%），交叉反应率为32%（恰加斯病25/65，皮肤利什曼病2/20），AUC为97.4%。rKDDR-plus ELISA正确识别58/59例阳性（敏感性98.3%，95% CI：91.0–99.9%）和80/81例健康阴性（特异性98.8%，95% CI：93.3–99.9%），交叉反应率为24.7%（恰加斯病18/65，皮肤利什曼病3/20），AUC为99.8%。结果表明两种抗原均具有较高的敏感性和特异性。

3.3 与巴西卫生部推荐快速检测的性能比较
以rK39为基础的LSH Ab ECO Teste快速检测在本研究血清面板中的敏感性为91.5%（95% CI：81.3–97.2%）、特异性为100%（95% CI：95–100%）。与rLci5 ELISA比较，κ=0.84（几乎完全一致），McNemar检验p=1.0；与rKDDR-plus ELISA比较，κ=0.93（几乎完全一致），p=0.074。两种重组抗原ELISA与快速检测的性能差异均无统计学意义，而rKDDR-plus ELISA在特异性上优于快速检测。

3.4 标准化间接ELISA的性能评估
采用蛋白A优化后，两种抗原的阳性样本平均OD值均有所提高：rLci5从1.530±0.891升至1.945±1.139，rKDDR-plus从1.244±0.352升至2.605±0.776。四种ELISA之间的配对比较显示，rLci5与rKDDR-plus ELISA之间κ=0.80（高度一致，p=0.823）；rLci5与其蛋白A优化版之间κ=0.84（几乎完全一致，p=0.453）；rKDDR-plus与其蛋白A优化版之间κ=0.91（几乎完全一致，p=1.000）；两种蛋白A优化版之间κ=0.72（高度一致，p=0.457）。结果表明蛋白A优化未显著改变检测结果的一致性，同时可提高检测信号强度。

讨论部分指出，现有血清学检测在识别低抗体水平的无症状感染者和免疫抑制患者时存在敏感性不足的问题，且难以区分活动性感染与治愈者。本研究中rLci5和rKDDR-plus的高敏感性和特异性与此前rLci5用于犬内脏利什曼病（canine visceral leishmaniasis, CVL）的研究结果一致，且rLci5为首次用于HVL诊断评估。与rK39快速检测相比，两种重组抗原ELISA在敏感性上相当，但rKDDR-plus在特异性上更优。与恰加斯病血清的交叉反应是两种抗原和快速检测共同面临的局限，可能源于利什曼原虫和锥虫属间共享的保守抗原表位，表位作图或血清交叉吸附可能是解决该问题的潜在策略。蛋白A作为检测试剂的可行性及跨物种IgG结合能力，为人畜共患病的整合监测提供了技术优势。尽管重组抗原ELISA需要实验室设备和专业人员，但其在参考实验室和确证实验室中仍具重要价值，且为未来开发快速检测试纸条奠定了基础。研究结论为：rLci5和rKDDR-plus在间接ELISA中检测人血清抗L. infantum特异性IgG抗体表现出高敏感性、高特异性和高准确性，可作为HVL血清学诊断的可靠工具；蛋白A可有效替代传统酶标二抗，且其广谱物种反应性支持其应用于人和动物储存宿主的整合监测；两种重组抗原优于目前巴西公共卫生系统采用的rK39快速检测，尤其快速检测在本研究血清面板中特异性仅为41.0%，而重组抗原ELISA显著更优；上述发现支持rLci5和rKDDR-plus作为下一代HVL血清学诊断平台的候选抗原，但需在可部署于现场的检测格式和更大规模、地理多样化的多中心队列中进一步验证。