年龄依赖性CD8+ T细胞向TCF7低表达细胞毒性表型的转录重编程驱动病毒性急性呼吸窘迫综合征中的免疫衰老

《iScience》：CD8+ T cell transcriptional reprogramming toward TCF7-low cytotoxicity drives immune aging in viral ARDS

　　

病毒性急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）在不同年龄组中表现出截然不同的临床结局，但其背后的免疫机制尚不明确。本研究整合了单细胞转录组分析、T细胞受体（T cell receptor, TCR）库分析、血清蛋白质组学和功能验证，以表征流感相关ARDS中年龄依赖性的T细胞重塑。与儿童ARDS相比，成人ARDS的特征在于TCR多样性降低、CD8+效应记忆T细胞（effector memory T cells）扩增以及以颗粒酶B（granzyme B, GZMB）表达升高为标志的增强型细胞毒性程序。在转录水平上，成人CD8+效应记忆T细胞呈现出一种TCF7低表达状态，该状态与TGFB1相关的RUNX3/PRDM1程序的激活相关联。进一步的体外实验表明，TGFB1促进了CD8+效应记忆T细胞的细胞毒性编程，并在共培养模型中增加了上皮损伤。这些发现将年龄相关的CD8+ T细胞重塑确定为导致病毒性ARDS免疫失调的一个潜在机制。

论文解读文章

研究背景与科学问题

病毒性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种由肺泡-毛细血管屏障弥漫性损伤引起的急性低氧性呼吸衰竭，其特点是肺通透性增加、肺顺应性降低和双肺浸润影。流行病学研究显示，成人ARDS的病死率显著高于儿童ARDS，提示这两个人群之间存在年龄依赖性的免疫学差异。免疫细胞介导的炎症是ARDS发病的核心机制。在急性期，由中性粒细胞和巨噬细胞驱动的先天免疫反应迅速触发“细胞因子风暴”，随后适应性免疫激活，其中T细胞参与组织损伤与修复的动态平衡。CD8⁺ T细胞扮演着双刃剑的角色——在清除感染靶细胞的同时，也可能对未感染的肺泡上皮细胞造成旁观者损伤。既往研究表明，儿童T细胞库展现出更大的多样性和抗原反应性，而成人T细胞由于免疫衰老，表现出抗原识别受损和效应活性失调，从而加剧肺损伤。然而，这些差异究竟是反映了T细胞亚群丰度的变化，还是CD8⁺ T细胞转录程序的协同转变，目前仍不清楚。因此，开展此项研究旨在阐明年龄依赖性CD8⁺ T细胞转录程序的重塑如何导致成人ARDS中免疫失调和更差的预后。

研究方法概述

研究人员采用了一套综合的多组学策略。首先，从中国人民解放军总医院第七和第八医学中心招募了包括儿科对照组（n=13）、儿科ARDS组（n=10）、儿科ARDS恢复组（n=10）、成人对照组（n=12）和成人ARDS组（n=9）在内的队列，收集外周血样本。主要关键技术方法包括：1）单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和T细胞受体测序（T cell receptor sequencing, TCR-seq）用于分析T细胞亚群组成、转录谱和克隆多样性；2）血清蛋白质组学用于筛选循环中的差异蛋白；3）伪时间轨迹分析用于推断T细胞分化路径；4）患者水平的伪批量相互作用分析用于区分年龄效应与疾病效应；5）体外功能验证实验，包括流式细胞术、qPCR和共培养模型，用于验证TGFB1对CD8⁺效应记忆T细胞细胞毒性编程和上皮损伤的影响。

研究结果

全球比较分析揭示成人ARDS中T细胞丰度降低、TCR多样性受损和颗粒酶活性升高：通过分析五组样本的单细胞数据，研究发现成人ARDS患者的T细胞比例和绝对淋巴细胞计数均低于儿童ARDS患者。差异表达基因（DEG）分析显示，成人ARDS对比成人对照以及成人ARDS对比儿童ARDS的比较中包含了最多的DEG。通路活性评分显示，成人对照组的颗粒酶介导的细胞死亡和细胞因子介导的信号传导活性已高于儿童对照组，且在成人ARDS中进一步增强。相反，淋巴细胞迁移和TCR复合体信号传导在成人中降低，在成人ARDS中降至最低。TCR库分析证实，成人ARDS患者拥有更低的独特克隆型比例和更低的多样性指数（香农多样性和辛普森均匀度），并且大克隆型和超扩增克隆型占比更高。

年龄相关的T细胞亚群分化和转录程序重塑：无监督聚类鉴定了主要的T细胞亚群。伪时间轨迹分析显示了从幼稚到记忆状态的进展。在稳态下，成人对照组相较于儿童对照组，CD4⁺和CD8⁺ T细胞均表现出幼稚细胞减少、记忆细胞（尤其是CD8⁺效应记忆T细胞）增加的特征。转录组比较发现，成人T细胞在多个细胞毒性亚群中颗粒酶介导的程序性细胞死亡通路评分更高，同时归巢相关亚群的淋巴细胞迁移评分更低，伴随归巢受体CCR7的下调。值得注意的是，在基线状态下，成人CD8⁺效应记忆T细胞并未显示出GZMB表达的普遍升高。

儿科ARDS表现为CD4⁺组成改变和CD8⁺功能重连而无GZMB上调：在儿科ARDS中，CD4⁺ T细胞亚群分布发生改变（中央记忆细胞增加），而CD8⁺ T细胞亚群分布基本不变，γδ T细胞丰度显著降低。转录层面，CD8⁺中央记忆T细胞上调了细胞毒性分子（如PRF1、GZMA、GZMB），但重要的是，GZMB在CD8⁺效应记忆T细胞中并未异常升高，表明这是一种功能性适应而非失控的细胞毒性激活。

成人ARDS进展以CD8⁺效应记忆T细胞扩增和GZMB上调为特征：成人ARDS患者表现出显著的CD8⁺效应记忆T细胞扩增。转录组分析揭示了CD8⁺中央记忆和效应记忆T细胞中广泛的DEG变化，富集于免疫效应、炎症和细胞毒性通路，而下调基因则与T细胞迁移和TCR信号传导相关。特别是，CD8⁺效应记忆T细胞中GZMB显著升高，同时伴有TCR复合体基因（CD3D/E/G, CD8B）的下调。后续的再聚类分析进一步确认，GZMB的升高源于一个特定的GZMB高表达细胞毒性亚群的扩增，而非所有效应记忆细胞的均一性升高。

对比分析揭示成人对比儿科ARDS的衰老特征和失调的细胞毒性：直接比较成人ARDS与儿科ARDS，结果进一步确认了成人患者中CD8⁺效应记忆T细胞的显著扩增和GZMB的高表达。通路评分显示，成人ARDS几乎所有T细胞亚群的细胞因子介导的信号传导均升高，而TCR复合体信号传导则在多数亚群中降低。颗粒酶介导的程序性细胞死亡在细胞毒性亚群中升高。代表性DEG分析证实了细胞因子/炎症基因上调、TCR复合体基因下调、细胞毒性分子（包括GZMB）上调以及CCR7下调的模式。

患者水平分析揭示CD8⁺效应记忆T细胞中年龄依赖性的记忆相关程序丢失：通过包含年龄、疾病状态及其交互项的DESeq2模型进行的患者水平伪批量分析，研究人员鉴定出对ARDS的反应在成人和儿童间存在差异的基因。其中，CCR7显示出最强的交互效应，其在成人ARDS中下降更为显著。此外，基于TCF7相关记忆基因集（TCF7, CCR7, IL7R, SELL, LTB, MAL）计算的记忆模块评分也在成人ARDS中显著降低，且存在显著的年龄×疾病交互作用，表明成人ARDS与记忆相关CD8⁺效应记忆T细胞程序的更大程度破坏相关。

儿科ARDS恢复期细胞毒性激活减弱：对儿科ARDS恢复期样本的分析显示，T细胞亚群组成保持稳定，但转录组分析表明，CD8⁺中央记忆和效应记忆T细胞中多种细胞毒性分子（包括GZMB）的表达下降，表明细胞毒性激活得到缓解，免疫功能部分恢复。

RUNX3/PRDM1-GZMB轴驱动成人ARDS中的异常细胞毒性激活：贡献度分析确定CD8⁺效应记忆T细胞是GZMB和PRF1的主要来源。韦恩图分析显示，RUNX3、PRDM1和GZMB在成人ARDS中一致上调，而TCF7持续下调。在CD8⁺效应记忆T细胞中，GZMB高表达亚群几乎不表达TCF7，这与此关键调控因子的转录抑制一致。

TGFB1介导成人ARDS中CD8⁺效应记忆T细胞的GZMB上调：整合的血清蛋白质组学发现，TGFB1在成人ARDS患者中显著升高。单细胞分析显示，TGFB1在外周血单个核细胞（PBMC）中的表达也增高，且CD8⁺效应记忆T细胞表达TGFB1受体（TGFBR1/2）。体外功能验证表明，TGFB1刺激可诱导CD8⁺效应记忆T细胞中RUNX3、PRDM1和GZMB的表达上调，并抑制TCF7。GSK-3β抑制剂SB216763可部分逆转这些效应。更重要的是，经TGFB1预处理的CD8⁺效应记忆T细胞与人肺泡上皮细胞（HPAEpiCs）共培养后，能显著促进上皮细胞凋亡，而SB216763处理可减轻这种损伤。

讨论与结论

本研究的讨论部分指出，成人ARDS患者表现出的T细胞衰老特征（包括CD8⁺幼稚T细胞减少、TCR库收缩和CD8⁺效应记忆T细胞扩增）并非孤立的效应基因变化，而是与一种更广泛的细胞毒性转录程序状态相一致。这些细胞表现出抗原识别和归巢能力受损，但细胞毒性分子（如GZMB和PRF1）表达增强。患者水平的年龄-疾病交互分析进一步将年龄相关的免疫重塑与ARDS相关的转录变化区分开来，揭示了成人ARDS中CCR7相关记忆特征的优先破坏。研究鉴定出的TGF-β-RUNX3-PRDM1轴的激活和TCF7的抑制与过度的GZMB表达和细胞毒性失衡相关，并通过体外实验得到了验证。

研究结论部分可以翻译为：总之，这项研究系统地描绘了成人和儿童ARDS之间T细胞的功能差异，并确定了由RUNX3-PRDM1-GZMB驱动的异常细胞毒性激活机制。这些发现为成人ARDS的免疫病理学提供了新的机制见解，并为开发基于T细胞的精准干预措施提出了潜在的治疗靶点。总的来说，这些发现支持了一个模型，在该模型中，成人ARDS的特征是CD8⁺ T细胞转录程序在TGFB1的关联下，向一种TCF7低表达的细胞毒性样构型转变。