世界最古老已知陆生动物Jonathan（Aldabra giant tortoise）极端长寿的基因组变异与低甲基化熵表观遗传启示

《SCIENCE ADVANCES》：Epigenetic insights into extreme longevity in the world’s oldest terrestrial animal, Jonathan

阿尔达布拉巨型陆龟（Aldabrachelys gigantea）具有极端长寿特征。研究人员对Jonathan——一只194岁的Aldabra巨型陆龟——的基因组（genome）和甲基化组（methylome）进行测序，以探索其长寿的分子基础。与其他巨型陆龟（A. gigantea 和 Chelonoidis abingdonii）相比，Jonathan在大多数衰老通路中具有独特的基因变异。此外，与另外四只年龄从5岁幼体到老年成体的Aldabra龟相比，Jonathan具有显著的DNA甲基化（DNA methylation）和甲基化熵（methylation entropy）改变。值得注意的是，研究人员发现Jonathan甲基化组中的低熵区域（lower-entropy regions）富集于参与线粒体电子传递链（mitochondrial electron transport chain）和RNA代谢（RNA metabolism）的基因启动子。这提示这些通路中基因的高保真转录（high-fidelity transcription）可能对长寿物种至关重要。研究人员的发现支持一种衰老模型，其中基因启动子中低甲基化熵的维持与高效的线粒体能量产生、高效的RNA加工和高效的基因组修复相耦合。

研究背景方面，近年来长寿研究多采用比较基因组学，聚焦裸鼹鼠、弓头鲸、Brandt’s bat、 immortal jellyfish以及非洲绿松石鳉鱼等长寿动物，并鉴定出可能延缓衰老和抑制癌症的基因标志。巨型陆龟以长寿著称，既往对两只Aldabra巨型陆龟和加拉帕戈斯巨型陆龟Lonesome George（Chelonoidis abingdonii）的基因组分析，发现了IGF1R、DCLRE1B和XRCC6等基因中与长寿相关的非同义单核苷酸变异（nonsynonymous single-nucleotide variants, nsSNVs）。然而，尚无研究评估巨型陆龟是否延缓或避免其他脊椎动物随龄积累的表观遗传变化，也未评估像Jonathan这样的极长寿个体是否具有独特表观遗传特征。Jonathan估计194岁，被认为是世界最古老已知陆生动物，生活在南大西洋圣赫勒拿岛；Tank为36岁圈养Aldabra巨型陆龟。基于Species360等分析，Aldabra龟成年预期寿命均值和上限约为80.47和93.68年，提示Jonathan约超出其物种通常上限100年。因此，研究人员将Jonathan基因组与表观基因组分析结合，以识别其极端长寿的潜在遗传和表观遗传基础。该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。

关键技术方法方面，因圣赫勒拿官员限制取血，研究人员以口腔刮取和唾液样本分离Jonathan的gDNA，因高分子量（HMW）gDNA失败而采用Illumina 2 × 150 bp短读测序；对圈养36岁Aldabra龟Tank取血获得HMW gDNA，结合PacBio HiFi和Omni-C Hi-C构建参考基因组。对Jonathan及另外四只Aldabra龟（5岁Hatchling、12岁Smalls、老年成体Toka和Poka）口腔DNA进行全基因组亚硫酸氢盐测序。分析包括比较基因组、正选择d_N/d_S、蛋白语言模型、AlphaFold2、STRING网络和甲基化熵（ME）计算。

研究结果如下。基因组序列、组装与注释：由于无法对Jonathan取血，研究人员用口腔样本获得短读数据，约1.1 billion reads、165 Gb；Tank血样用于PacBio HiFi和Omni-C Hi-C组装，得到211个scaffolds、约2.41 Gb参考基因组。Jonathan reads对Tank基因组比对率93%、平均覆盖60×，鉴定6.9 million高质量变异并构建约2.41 Gb一致性参考基因组，预测25,738个蛋白编码基因，其中16,466个获功能注释；线粒体基因组组装为单contig，与Aldabra参考线粒体NC_028438.1 100%一致。

Jonathan的生物地理学：依据Aldabra龟“走出非洲”扩散假说，研究人员将Jonathan和Tank加入既往Aldabra种群主成分分析（PCA）和admixture分析。Tank与Hermania、Maleika相似，接近western Grande Terre；Jonathan更接近Grande Terre但距离更远，可能更早离开Aldabra atoll，或源自Granitic Seychelles。K=5时Jonathan的admixture独特，提示其具有未知来源的遗传贡献。

正选择基因：研究人员以d_N/d_S > 1分析，在Jonathan基因组中鉴定770个显著正选择基因（PSGs），涉及DNA修复、胰岛素调节、线粒体功能、端粒功能等。GO富集显示发育、代谢、免疫及端粒酶RNA定位、DNA修复、胰岛素调节、NAD生物合成等衰老相关通路；STRING网络形成DNA修复、线粒体功能、胰岛素调节、氧化应激和心肌收缩等簇。

巨型陆龟共享的nsSNVs：与Lonesome George研究中的2,629个长寿相关基因和13个nsSNVs比较，Jonathan共享其中多个变异，涉及DNA修复（ATM、XRCC5、XRCC6、TP53）、端粒功能（DCLRE1B）、葡萄糖/胰岛素调节（MIF、IGF1R、IGF2R、GSK3A）和线粒体功能（ALDH2）等；其中ALDH2和XRCC5在Jonathan中亦为正选择。

Jonathan独特的nsSNVs：与Tank、Lonesome George和人类比较，研究人员在Jonathan中发现287个基因具有独特nsSNVs，其中22个为正选择，包括DNA修复基因POLQ、POLE2和端粒酶基因POT1。利用四种蛋白语言模型和一种变异效应预测器，鉴定41个基因具有潜在功能显著nsSNVs，12个属于LongevityMap和GenAge，包括ACD、POT1、ERCC1、TP53BP1、FOXO3和CIC。AlphaFold2预测显示主要以侧链差异为主，XRCC3的P159R尤为突出，Jonathan为亲水精氨酸，Lonesome George为组氨酸，人类为疏水脯氨酸。

基因扩张：Jonathan在11个龟特异性扩张基因家族中的9个具有拷贝数增加。LAMTOR4为Ragulator复合体成员并调节mTORC1，Lonesome George及三个测序Aldabra龟均有2个拷贝，第二拷贝LAMTOR4_JON2含5个人类变异，其中2个预测为 damaging。VCP在Lonesome George和Jonathan中重复，参与DNA损伤反应和TP53BP1招募。非龟特异性扩张家族包括肿瘤抑制、免疫、癌症和DNA修复基因；Jonathan有10个perforin基因Prf1拷贝，Lonesome George有7个。

甲基化组分析：研究人员对Jonathan、Hatchling、Smalls、Toka和Poka进行全基因组亚硫酸氢盐测序，获得208至362 million raw reads，平均覆盖10至17×，亚硫酸氢盐转化率>99%。Jonathan相较5岁Hatchling全局甲基化降低；Jonathan与Hatchling间鉴定67,091个差异甲基化区域（DMRs），其中90.9%在Jonathan中低甲基化，主要位于intergenic和intronic区域，仅5%位于启动子或外显子。高甲基化DMR覆盖218个基因，富集发育通路，包括泌尿和心血管发育，并包含PRC2靶基因和多个homeobox及master transcription factor基因。ME分析显示Jonathan在多数基因组区域ME高于年轻龟，但所有五只龟启动子ME均低；全基因组平均ME由年龄显著预测（P = 0.01787；R² = 0.9821），启动子平均ME亦与年龄高度相关（P = 0.003；R² = 0.9604）。研究人员在2,895个启动子中鉴定272个基因启动子，其在Jonathan、Hatchling和Smalls中低ME，而在Toka和Poka中较高。该基因集富集线粒体组织、RNA加工和染色体组织相关过程；约30%属于衰老标志，13%参与线粒体过程，包括复合体IV、复合体I、嵴形成和线粒体自噬；25个涉及RNA加工/剪接和翻译，15个涉及基因组/端粒修复。与Open-Genes人类长寿数据库重叠11个基因，其中6个与线粒体相关，DGAT1和BECN1置信度较高。

讨论部分，研究人员在Jonathan中鉴定出涉及DNA修复、端粒维持、自噬、胰岛素调节、线粒体功能和癌症的独特变异，并确认LAMTOR4扩张及其额外拷贝中预测 damaging变异，可能部分抑制mTORC1。Jonathan全基因组亚硫酸氢盐测序显示随龄全局DNA甲基化下降，与人类百岁老人相似；高甲基化DMR富集发育基因和PRC2靶标，提示干细胞可塑性丧失和组织衰退。Jonathan ME高于Hatchling，但启动子ME相当；类似人类长寿个体，百岁老人启动子ME低于老年人。低熵启动子中涉及线粒体组织和RNA代谢的基因可能对长寿关键。线粒体内膜和氧化磷酸化复合体I、IV富集，线粒体ATP和ROS生成及线粒体功能障碍是衰老标志，长寿物种常表现较低线粒体ROS产生和电子传递链自由基泄漏。研究人员提出一个衰老反馈模型：甲基化胞嘧啶自发脱氨为胸腺嘧啶驱动全局去甲基化和熵增；维持线粒体功能、核修复和RNA加工相关基因启动子低熵，可降低转录噪声并维持高效功能，高效ATP产生支持基因组修复和CpG恢复。但数据不足以支持直接因果，仅评估约10%启动子，需血液更深甲基化覆盖验证。局限性包括不能取Jonathan血液，无法长读测序、分离RNA、RNA-seq验证独特nsSNVs及评估ME与转录方差关系；ME比较仅用口腔DNA，理想应用血液；还需更多动物数据判断ME模式是否Aldabra特异或普遍衰老特征。研究结论翻译：总之，尽管研究人员在Jonathan中发现了许多与已知衰老通路相关的遗传变异，但最显著的发现是特定基因启动子内维持的低熵状态。这种稳定性在参与线粒体功能和RNA加工的基因启动子中尤为明显。研究人员假设，维持这种低熵状态可确保这些关键通路的高保真表达，从而部分保护其免受年龄相关衰退。