CB1受体抑制恢复脆性X综合征小鼠突触神经小体中可变剪接景观的完整性

《iScience》：CB1 receptor inhibition restores synaptoneurosomal alternative splicing landscape in fragile X syndrome mice

　　

摘要 脆性X综合征（Fragile X syndrome，FXS）是最常见的遗传性智力障碍和自闭症病因，涉及认知功能与突触可塑性损伤。临床前研究表明，抑制1型大麻素受体（cannabinoid type-1 receptor，CB1R）可恢复Fmr1敲除（FX）小鼠的关键表型特征。然而，其潜在的分子机制仍未明确。研究人员分析了海马突触神经小体（synaptoneurosome）转录组，并证实突触神经小体能够准确反映突触相关的mRNA组成与功能。随后，研究人员在给予CB1R药理学抑制的雄性FX小鼠中分析了该转录组，发现利莫那班（rimonabant）在基因表达水平上的影响有限。值得注意的是，对可变剪接（alternative splicing，AS）的详细in silico分析揭示，利莫那班可将FX小鼠中大量的AS事件恢复至野生型水平。突触神经小体中AS景观的这些变化提示了一种新机制，即靶向CB1R可能通过恢复特定的AS模式发挥治疗作用。综上所述，研究结果揭示了FXS背景下新的分子改变，这些改变对与认知改善相关的药理学治疗敏感。

一、研究背景与科学问题

脆性X综合征（Fragile X syndrome，FXS）是最常见的遗传性智力障碍病因，同时也是最常见的单基因自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）致病因素，男性发病率约为1:4000，女性约为1:8000。该疾病由X连锁的脆性X信使核糖核蛋白1基因（FMR1）5′非翻译区（5′ untranslated region，5′ UTR）中三核苷酸CGG重复序列异常扩增所致，导致FMR1基因启动子区高度甲基化，进而使FMRP蛋白（Fragile X messenger ribonucleoprotein，FMRP）缺失。FMRP是一种RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP），在突触前和突触后区室中发挥局部mRNA调控的关键作用，以维持突触可塑性和连接性。此外，FMRP还调控转录因子、染色质修饰酶及其他在RNA合成和功能中发挥关键作用的RBP的活性。

Fmr1敲除（FX）小鼠模型是研究FXS最广泛使用的动物模型，能够部分重现FXS患者的表型特征，如轻度认知缺陷、多动或自闭样行为，并再现神经元异常，包括树突棘密度和形态的改变、兴奋性/抑制性（excitatory/inhibitory，E/I）平衡失调，以及海马CA1区I组mGluR5依赖性长时程抑制（long-term depression，LTD）的增强。这些过程对突触稳态和可塑性的正确建立至关重要，其功能障碍可能是FMRP在突触接触位点特异性缺失的直接后果。

内源性大麻素系统（endocannabinoid system，ECS）是一种内源性神经调质网络，在认知相关过程中发挥重要作用。其中，1型大麻素受体（cannabinoid type-1 receptor，CB1R）作为ECS的主要大麻素受体，可通过药理学或遗传学手段抑制以改善FX模型的关键表型。已有研究表明，CB1R的药理学抑制和遗传抑制均可改善FX小鼠的认知缺陷。此外，低剂量的利莫那班（rimonabant），一种选择性CB1R拮抗剂/反向激动剂，可纠正FX小鼠中异常的mGluR5-LTD和海马棘密度改变。然而，利莫那班在FX小鼠中产生行为和神经学改善的分子标志物仍不清楚。

基于上述背景，本研究旨在利用突触神经小体（synaptoneurosome）制备方法，系统评估FXS背景下突触相关mRNA的改变，并探讨CB1R药理学抑制对突触转录组及可变剪接（alternative splicing，AS）景观的调控作用。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用高通量RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）技术，对来自同一动物的海马突触神经小体（HC-SYN）和全海马组织（HC-BULK）转录组进行比较分析，以评估突触神经小体制备对突触相关RNA物种检测的改善效果。随后，对雄性FX小鼠和野生型（WT）同窝小鼠进行为期7天的利莫那班（0.1 mg/kg，腹腔注射）或溶媒处理，获取海马突触神经小体进行转录组测序。基因表达差异分析（differential gene expression，DGE）采用DESeq2软件包，转录本差异表达分析（differential transcript expression，DTE）同样基于DESeq2进行。可变剪接分析采用SUPPA软件，涵盖外显子跳跃（skipping exon，SE）、可变首外显子和可变末外显子（alternative first and last exon，AF和AL）、可变5′和3′剪接位点（alternative 5′ and 3′ splice-site，A5和A3）、互斥外显子（mutually exclusive exons，MX）以及内含子保留（retained intron，RI）等剪接事件类型。基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析采用clusterProfiler软件包，突触功能注释采用SynGO数据库。此外，研究人员还利用定制TaqMan探针和RT-qPCR技术，在独立且更大规模的样本队列中对筛选出的关键AS事件进行了验证。RNA-seq原始数据已分别提交至GEO数据库（GSE284627和GSE285032）。

三、研究结果

1. 突触神经小体对突触转录组具有稳健的代表性

通过比较来自同一动物的海马突触神经小体与全海马组织的转录组，主成分分析（PCA）显示亚细胞分级分离（而非小鼠个体来源）是影响转录组特征的主要因素。DGE分析共鉴定出749个在突触神经小体中显著富集的基因和1,019个显著耗竭的基因。GO富集分析显示，富集基因主要涉及突触结构和跨膜转运相关条目。SynGO突触功能注释分析进一步证实，突触神经小体中显著富集的基因中有相当数量属于突触相关基因。上述结果证实突触神经小体能够准确反映突触组成和功能，为后续研究提供了可靠的实验体系。

2. 亚慢性CB1R抑制逆转FX突触神经小体中Mff、Hnrnpd和Slain2的表达

FX小鼠与WT小鼠突触神经小体的DGE比较分析发现29个上调基因和19个下调基因，其中包括与树突分支相关的Pcdhgb5、与ERK磷酸化级联相关的Gpr37，以及下调的Fkbp5和参与mTORC1信号通路的Rheb。利莫那班处理在FX突触神经小体中改变了14个基因的表达，而在WT小鼠中仅影响3个基因，且与FX样本中的变化无重叠。进一步分析发现，Mff、Hnrnpd和Slain2三个基因在基因型比较和治疗比较中呈现相反方向的表达变化。RT-qPCR在独立且更大规模的突触神经小体样本中验证了Mff和Hnrnpd在FX小鼠中的表达下调及利莫那班对Mff表达的逆转效应，但这些变化在全海马匀浆中未检测到，凸显了突触神经小体制备在检测突触特异性RNA表达变化中的重要性。

3. 差异转录本表达分析揭示CB1R抑制在FX小鼠中的显著效应

DTE分析显示，FX小鼠突触神经小体与WT相比有254个差异表达转录本（145个上调，109个下调）。GO富集分析表明，上调和下调转录本均富集于突触结构和突触组织相关条目，而下调转录本还富集于mRNA加工和RNA剪接等生物学过程，其中包括Celf2和Hnrnp家族成员等剪接因子。利莫那班处理后，FX突触神经小体中有211个转录本发生差异表达（135个上调，76个下调），上调转录本富集于突触组织、mRNA剪接和神经元分化等过程，涉及Samd4b、Acin1及Hnrnp家族（Hnrnpa2b1、Hnrnpk和Hnrnpd）等基因。值得注意的是，在FX突触神经小体中差异表达的转录本中，34%在利莫那班处理后向相反方向改变，其中109个下调转录本中有59个（54%）在治疗后上调（超几何检验，p = 1.8e^?10），且这些被逆转的转录本相关基因富集于mRNA加工和剪接通路，提示利莫那班可能通过影响mRNA剪接机制来改善FX小鼠的突触异常。

4. FX突触神经小体呈现对利莫那班敏感的AS事件模式

AS分析显示，FMRP缺失导致206个基因的259个AS事件发生失调，其中AF和SE是最主要的剪接事件类型。涉及的基因包括与突触传递和突触形态相关的Cpeb2、FosB、Arf4、Cacng5和Vdac3等。利莫那班处理改变了FX突触神经小体中130个基因的178个剪接事件，涉及编码离子通道和酶的基因如Gprin1、Kcnip4、Gabra5、Celf1、Mecp2、Hnmt和Arc等。将基因型比较和治疗比较的AS事件重叠后，发现56个基因的77个剪接事件在两种比较中均显著，且两者之间呈现显著的负相关（Pearson R = ?0.97，p < 2.2e^?16），表明利莫那班可逆转FX小鼠中大量AS事件的方向。单细胞数据集交叉分析显示，这些基因中约67%主要在神经元中表达。重要的是，大多数对CB1R抑制敏感的AS事件在WT小鼠中不受利莫那班影响，表明其调控具有基因型特异性。

5. 计算机预测的剪接事件通过特异性探针得到验证

研究人员基于功能相关性、转录本丰度和逆转幅度，优先选择了三个脑特异性RBP的AS事件进行验证：Ddx6（A5事件）、Celf1（AF事件）和Cpeb2（SE事件）。在独立且更大规模的突触神经小体样本中，RT-qPCR验证结果显示：Ddx6外显子包含和排除转录本在FX小鼠中均下调，利莫那班处理后均上调；Celf1外显子包含转录本在FX小鼠中降低，治疗后显著增加，外显子排除转录本在治疗后也显著增加；Cpeb2外显子包含在FX小鼠中减少，利莫那班处理后恢复。实验性dPSI计算确认Cpeb2 SE事件的变化方向与in silico结果一致。这些AS事件相关的转录本异构体在全海马匀浆中未发生改变，进一步验证了突触神经小体制备在研究特定转录本变异中的必要性。

四、讨论与结论

本研究表明，FMRP缺失导致海马突触神经小体中基因表达模式发生改变，这些改变在转录本独立分析和AS事件分析中最为明显。利莫那班以极低剂量（0.1 mg/kg，7天）进行亚慢性全身给药，可在不改变WT小鼠突触转录组的情况下，逆转FX小鼠突触神经小体中大量AS事件的方向，且这些效应具有基因型特异性。值得注意的是，对CB1R抑制敏感的AS事件所涉及的基因中，有相当数量编码RBP，包括经验证的Ddx6、Celf1和Cpeb2。研究人员提出，FMRP可能并非剪接的直接调控因子，而是通过调控下游RBP间接影响RNA加工过程。CB1R抑制可能通过恢复关键RBP（如Celf1和Cpeb2）的特异性AS模式，触发级联反应以正常化突触微环境。特别是Cpeb2 AS事件中，包含异构体与翻译激活相关，排除异构体与翻译抑制相关，FX小鼠中Cpeb2包含异构体的减少可能导致过度局部蛋白质合成，而利莫那班恢复Cpeb2排除异构体可能有助于减弱蛋白质合成并恢复突触可塑性。综上所述，CB1R抑制在FXS背景下通过修饰特定RBP的突触mRNA剪接，可能与其先前证实的表型改善相关，这为FXS的治疗提供了新的、区室特异性的分子机制基础。