利用PhiC31整合酶在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中靶向整合染色体外阵列的PhIAT方法

《SCIENCE ADVANCES》：Targeted integration of extrachromosomal arrays in C. elegans using PhiC31 integrase

　　

染色体外阵列（extrachromosomal arrays）是由注射到秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）生殖系中的DNA产生的独特染色体样结构。然而，除非整合到染色体中，否则它们不稳定。当前使用X射线（x-rays）或CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）的整合方法可损伤DNA且效率低。研究人员证明，介导短attB和attP序列之间非诱变重组的病毒整合酶PhiC31（PhiC31 integrase），可用于极其高效且靶向的阵列整合。阵列通过PhIAT（PhiC31-mediated integration of arrays of transgenes，PhiC31介导的转基因阵列整合）整合到三条染色体上的attB位点，包括一个荧光着陆垫（fluorescent landing pad）处。此外，通过同时共注射Cas9核糖核蛋白（Cas9 ribonucleoprotein）、attB修复模板和阵列的DNA组分，可将整合插入基因组中任意位点，从而在所有六条染色体上提供位点。单次注射可整合大小范围为1至18兆碱基（megabases）的阵列。PhIAT使在秀丽隐杆线虫中研究其他生物基因组变得实用；研究人员的一个品系在秀丽隐杆线虫基因组的单个位点整合了酵母基因组的65%。PhIAT将加速秀丽隐杆线虫中从使用不稳定染色体外阵列向直接整合阵列的转变。

研究背景：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）转基因研究长期依赖染色体外阵列（extrachromosomal arrays，由注射生殖系DNA组装形成的染色体样微型结构）。这些阵列简单、快速、高效，可通过同源重组和非同源末端连接形成兆碱基级环状微型染色体，但可在体细胞中丢失且不遵循孟德尔分离，若不整合入染色体则不稳定。现有整合方法均需DNA损伤：电离辐射（ionizing irradiation）随机整合，效率约1%至5%，常伴背景突变和染色体易位；CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）虽可靶向，但仍会在基因组和阵列中产生双链断裂，效率约1%至10%，具有诱变风险，且整合阵列不一定与亲本阵列相同。因此，仍需一种简单、高效、非诱变且靶向的染色体外阵列整合方法。丝氨酸整合酶（serine integrases）PhiC31通过attB（细菌附着位点）和attP（噬菌体附着位点）介导单向重组，已在多种生物系统中用于转基因插入，并在C. elegans生殖系中具有活性。研究人员开发了PhIAT（PhiC31-mediated integration of arrays of transgenes，PhiC31介导的转基因阵列整合），证明可高效、靶向、非诱变地整合染色体外阵列。该研究得出：单次注射可整合1至18兆碱基（Mb）阵列，覆盖全部六条染色体，一个品系在单一位点携带65%酵母基因组。其意义在于推动C. elegans从使用不稳定染色体外阵列转向直接整合阵列，并为在其他生物基因组研究中使用线虫提供平台。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

主要关键技术方法概括：研究人员构建含attB位点并在生殖系表达PhiC31的C. elegans品系；将含attP、选择标记和转基因货物的DNA混合物注射到生殖系形成阵列，经PhiC31介导attB×attP重组实现整合；使用HygR（潮霉素抗性）、G418、puromycin（嘌呤霉素）或unc-119(+)选择，通过荧光和遗传映射筛选纯合整合。采用短读全基因组测序、Oxford Nanopore长读测序和Flye组装分析阵列大小与结构；利用Cas9 RNP（Cas9核糖核蛋白）和ssODN（单链寡脱氧核苷酸）一步敲入attB并同时整合阵列；进行荧光成像、繁殖力和X染色体分离测定评估稳定性；使用酵母gDNA作为填充DNA。

结果部分：

染色体外阵列通过PhiC31高效整合。研究人员在染色体I携带attB、染色体II表达PhiC31的品系中注射含HygR::attP、泛肌肉TagRFP-T和填充DNA的混合物，经潮霉素选择和纯合RFP筛选，12个板中6个获得纯合整合（50%），重复实验平均整合率61%。全长197 bp attP效率为89%，最小39 bp attP为57%，43 bp线性attP为91%。对照缺少PhiC31、attB或attP时均无整合。F3代7/15线、F5代再3线获得纯合阵列，提示整合发生在F1生殖系。非整合线21个中20个attB位点突变。38个整合子均遗传映射到染色体I。结论：PhIAT高效、特异且快速。

用于靶向阵列插入的品系和DNA试剂。研究人员用CRISPR在染色体I、II、IV的安全港位点插入attB，这些位点未标记，需通过PCR或平衡子追踪；染色体II和IV的PhiC31转基因均可高效整合。长期保存建议将attB与PhiC31分开，因为PhiC31单独结合attB可导致位点突变。为便于重建注射品系，构建了带Him突变和荧光标记的平衡子。F1杂合子注射仍可整合，7个存活线中5个获得纯合插入。结论：提供了可用的品系和DNA资源。

整合阵列具有多样性。注射Psnt-1::YFP::H₂B、HygR::attP和酵母gDNA到PhiC31 II; attB IV品系，16个潮霉素抗性阵列线中10个生成整合子（63%）。YFP亮度在阵列间相差8倍。短读测序估计10个阵列大小，7个为1.3至4.6 Mb，其余为7.8、15和22.7 Mb。YFP亮度大致与阵列大小相关，oxIs698例外。酵母基因组占比为9.2%至64.8%，10个阵列累计覆盖93%酵母基因组，缺失826 kb。酵母片段平均长度12.7 kb，提示多数酵母基因完整。Monte Carlo模拟提示无明显不可掺入区域，但不能排除特定基因或端粒、着丝粒等结构区被排除。结论：单次注射可获得多样阵列。

整合阵列的长读组装。研究人员优化高分子量DNA提取并用Nanopore测序，选择oxIs691、oxIs693和oxIs695组装。超过50%的Nanopore读长大于15 kb，部分超过150 kb，使用大于50 kb读长组装。oxIs691为1.6 Mb完整无缺口组装；oxIs693为17.9 Mb（短读估计22.7 Mb），oxIs695为6.6 Mb（短读估计7.8 Mb）。attL和attR位点在插入端完好。oxIs691含5/6全长YFP、16/24全长HygR和111个酵母片段，酵母占96.1%；oxIs695含32/54全长YFP、238/384全长HygR和558个酵母片段，酵母占88.9%；oxIs693含73/109全长YFP、502/772全长HygR和1446个酵母片段，酵母占92%。两个最大阵列因大重复未完全组装，每个有21个大于50 kb的重复区域。HygR片段显著聚集（P < 1 × 10^?5），YFP片段随机分布。结论：阵列高度重复但可组装，HygR聚类原因尚不清楚。

一步法attB和阵列整合。研究人员单次注射Cas9 RNP、ssODN attB修复模板和阵列DNA组分，靶向染色体III、V、X的新位点。染色体III中18线有13个整合（72%）；染色体V中11线有7个（64%）；染色体X中18线有4个（22%）。17个测序线中11个（65%）在染色体连接处有正确attR位点；4个线无attR，类似FLInt修复机制；2个线未能鉴定连接。结论：可在任意位点整合，但效率低于已有attB位点，主要通过先敲入attB再经PhiC31重组。

在荧光着陆垫整合。研究人员将attB插入肠道表达CyOFP转基因的内含子，位于染色体I、II、IV。染色体I着陆垫与PhiC31品系杂交，注射线性泛肌肉TagRFP-T和HygR::attP。25个F1线中11个潮霉素抗性整合伴随CyOFP表达丢失（44%）。另有1线整合但未丢失CyOFP，1线丢失CyOFP但未整合阵列。结论：可通过破坏荧光着陆垫筛选整合。

大整合的稳定性和后果。研究人员检测18个独立整合子的荧光稳定性，子代均无亮度变化。7个整合子纯合或杂合时繁殖力多数相似（平均200至278个后代），少数异常但后代恢复正常，oxIs695重测中一系无菌。9个阵列雄性杂交实验中，7个与X染色体分离（雄性频率大于0.67）；oxIs691（IV 1.7 Mb）不分离（0.43），oxIs693（IV约17 Mb）和oxIs695（IV约8 Mb）强分离（0.96和0.87）。雌雄同体中X染色体分离不受影响，但雄性传递时获得带阵列雌雄同体较难。结论：大阵列可稳定传代，但在雄性减数分裂中与X染色体分离。

讨论部分总结：PhIAT可实现高效、靶向、非诱变的阵列整合，单次注射即可获得多种阵列。与mosTI和FLInt等当前靶向方法相比，PhIAT效率高，但直接比较受测量代数和选择策略影响。主要问题是PhiC31在无attP靶点时突变attB，因此不宜长期维持同时含attB和组成型PhiC31的注射品系，未来可改进为诱导型生殖系表达或注射纯化PhiC31蛋白。阵列多样性有助于优化多转基因化学计量。长读组装补充了C. elegans已测序阵列资源。大阵列总体稳定，但两个最大整合子品系生长缓慢。雄性减数分裂中，大阵列倾向于与X染色体分离。研究结论翻译：研究人员注意到这些阵列主要由酵母DNA组成；酵母基因组为12.1 Mb，10个阵列的序列数据覆盖93%酵母基因组，单个阵列覆盖63%。这些方法未来可能使C. elegans成为研究其他生物基因组演化与功能的熔炉，跨越物种边界。