Asn333高甘露糖N-糖链缺失损害ACP3折叠并驱动疾病相关功能障碍

《iScience》：Loss of the Asn333 high-mannose N-glycan impairs ACP3 folding and drives disease-associated dysfunction

　　

破坏N-糖基化基序的错义突变可扰乱蛋白质折叠和转运，然而单个N-糖链对蛋白质稳态的位点特异性贡献仍知之甚少。本研究解析了人前列腺酸性磷酸酶（ACP3）中三个N-糖基化位点的功能层级。糖蛋白组学分析显示，Asn94和Asn220主要携带复杂型N-糖链，而Asn333富含高甘露糖型结构。糖链缺失的N94Q和N220Q变体可有效分泌并保留磷酸酶活性，而N333Q和T335M在细胞内蓄积，形成内质网聚集体，并缺乏酶活性。分子动力学模拟揭示，Asn333高甘露糖糖链与周围残基形成持续氢键网络，并表现出显著降低的构象灵活性，支持其非冗余的结构作用。携带杂合p.T335M变体的个体出现严重神经发育异常，将Asn333糖链缺失与体内蛋白质稳态失败联系起来。这些发现建立了一种位点特异性糖链-蛋白质稳定机制，对糖蛋白折叠和人类疾病具有广泛意义。

蛋白质N-糖基化是一种位点选择性但结构异质的翻译后修饰，在蛋白质折叠、构象稳定性、细胞内运输和蛋白质稳态中发挥关键作用。N-糖链在内质网中共翻译添加到Asn-X-Ser/Thr一致序列的天冬酰胺残基上，并参与质量控制通路。根据高尔基体加工程度，N-糖链分为高甘露糖型、杂合型和复杂型，其中高甘露糖型为Man_5–9GlcNAc₂结构。尽管N-糖基化广泛促进蛋白质成熟，但单个糖基化位点可能具有非等价的结构效应。破坏N-糖基化序列的致病性错义变体与多种遗传病相关，但特定N-糖链对蛋白质结构稳定和功能输出的贡献仍不清楚。人前列腺酸性磷酸酶（ACP3）是一种分泌型N-糖蛋白，其折叠、二聚化和酶活性与分泌途径成熟紧密耦合。ACP3是一个同源二聚体酸性磷酸酶，在酸性条件下催化多种底物去磷酸化，其分泌对功能活性必不可少。ACP3除前列腺外也表达于脑等其他组织。晶体和冷冻电镜结构显示ACP3每条多肽链含有三个N-糖基化位点Asn94、Asn220和Asn333，其中Asn94和Asn220主要携带复杂型糖链，Asn333主要携带高甘露糖型糖链。早期研究提示Asn333糖基化对分泌和酶活性重要，但其结构机制和疾病关联尚不明确。为此，研究人员系统解析了ACP3三个N-糖基化位点的功能层级，并将Asn333糖链缺失与人类神经发育疾病联系起来。

为开展研究，研究人员构建了重组野生型ACP3及五个糖链缺失变体（N94Q、N220Q、N333Q、T335M和N94Q/N220Q双突变体），在Expi293F和HEK293细胞中表达，定量评估分泌效率、酶活性、细胞内定位和构象稳定性。采用聚焦蛋白质糖组学和位点特异性LC-MS/MS糖肽分析确定各N-糖链类型；采用免疫荧光、透射电镜和免疫电镜观察细胞定位和超微结构；采用蛋白酶K敏感性实验评估错误折叠；采用4-甲基伞形酮磷酸酯底物测定磷酸酶活性；基于ACP3晶体结构（PDB:1CVI）进行全原子分子动力学模拟，分析糖链构象变化和分子间相互作用。样本队列来源于约3000名罕见未诊断疾病患者及其父母的三方全外显子组测序数据，鉴定出三个携带新生杂合ACP3 p.T335M变体的无关个体。

**Asn333 N-glycosylation is essential for ACP3 secretion**：通过Ni²⁺亲和纯化和定量免疫印迹，WT ACP3可高效分泌，N94Q和N220Q变体分泌量下降但仍有分泌，N333Q和T335M几乎不分泌并主要留在细胞内；PNGase F和Endo H处理显示细胞内蛋白携带未成熟N-糖链。这证明Asn333糖基化是有效分泌所必需的。

**Asn333 predominantly carries high-mannose N-glycans**：聚焦糖组学显示WT ACP3中杂合/复杂型糖链约60%，而仅保留Asn333的N94Q/N220Q双突变体中高甘露糖型比例显著升高。LC-MS/MS糖肽分析显示Asn94和Asn220以复杂型为主（分别81%和91%），Asn333几乎全部为高甘露糖型（>99%），其中Man₆GlcNAc₂占78%。这证明Asn333是ACP3高甘露糖糖链的主要载体。

**ACP3 N333Q and T335M variants accumulate in the ER and form intracellular aggregates**：共聚焦免疫荧光显示WT、N94Q和N220Q与高尔基体标志物GOLPH2共定位，而N333Q和T335M与内质网标志物calnexin共定位并形成核周聚集体；定量分析显示这些变体仅定位于ER或形成聚集体。这证明Asn333糖链缺失导致内质网滞留和聚集。

**Intraluminal ACP3 aggregates and ER lumen expansion in cells expressing N333Q and T335M variants**：透射电镜显示N333Q和T335M表达细胞中电子致密聚集体被膜包裹并位于ER腔内，且ER腔扩张；免疫电镜在ER腔和聚集体周围检测到ACP3信号。这从超微结构证实错误折叠蛋白在ER腔内积聚。

**Intracellular N333Q and T335M ACP3 variants exhibit increased protease susceptibility consistent with misfolding**：蛋白酶K敏感性实验显示N333Q和T335M较WT显著更易被降解，N220Q中度敏感。此外，Ni²⁺亲和纯化中N220Q、N333Q和T335M与钙网蛋白共洗脱，表明与ER质量控制分子结合。这提示Asn333糖链缺失导致ACP3错误折叠和构象不稳定。

**Site-specific effects of N-glycosylation on ACP3 phosphatase activity**：以4-甲基伞形酮磷酸酯为底物测定磷酸酶活性，WT有明显活性，N94Q和N220Q保留大部分活性，N333Q和T335M无可检测活性。这说明Asn333糖链通过维持蛋白质折叠间接决定酶活性。

**The Asn333 N-glycan stabilizes ACP3 through extensive intramolecular interactions**：分子动力学模拟显示，Asn333连接的GlcNAc残基波动显著低于Asn94和Asn220位点；Asn333糖链与蛋白质的接触面积最大（约210 ?²），并通过与Asn304、Glu334、Tyr340的稳定氢键（频率>70%）形成“结构钳”。去除Asn333糖链后周围残基波动增加。这解释了Asn333糖链的非冗余结构稳定作用。

**Clinical manifestations in patients harboring the ACP3 T335M variant**：三个无关个体携带新生杂合p.T335M，均表现为发育迟缓、癫痫等神经发育异常，影像学有脑室增大或脑干钙化等；该变体在人群中罕见。结合分子数据，T335M废除Asn333糖基化，导致功能丧失，提示ACP3功能缺失可能通过腺苷信号等影响神经功能。

研究人员在讨论中指出，本研究确立了一种位点特异性糖链-蛋白质稳定机制：单个N-糖链可作为化学编码的结构稳定剂，在同一糖蛋白内各糖链以层级方式而非冗余方式发挥作用。该机制可能广泛存在于其他糖蛋白中。研究限制包括重组表达系统可能不完全反映内源环境、缺乏患者来源样本、病例数少限制基因型-表型关联。

研究结论：总而言之，本研究将Asn333连接的N-糖基化鉴定为ACP3稳定性和酶活性的化学编码结构决定因素。这种糖链介导的稳定作用在ACP3的T335M变体中被破坏，为连接蛋白质错误折叠与神经发育异常提供了分子框架。更广泛地说，研究结果表明单个N-糖链可充当化学编码的结构稳定剂，在同一糖蛋白内以层级而非冗余的方式起作用。在此背景下，位点特异性N-糖链异质性编码不同的结构信息，不同糖链对构象稳定性和蛋白质稳态的贡献不等。这一原理超越ACP3，可能代表哺乳动物系统中糖链多样性微调蛋白质折叠效率和功能稳健性的一般机制。