皱叶猫儿菊与硬毛猫儿菊中异艾黄酮及木犀草素糖苷的分离与化学表型研究

《Biochemical Systematics and Ecology》：Isoetin and luteolin glycosides from Leontodon crispus and Leontodon hispidus (Cichorieae, Asteraceae)

　　

专业摘要翻译：从皱叶猫儿菊（Leontodon crispus）与硬毛猫儿菊（Leontodon hispidus）的叶片中分离得到七种黄酮类化合物（flavonoids）。其中包含两种木犀草素糖苷（luteolin glycosides）和五种异艾黄酮糖苷（isoetin glycosides）。研究人员描述了两种此前未见报道的异艾黄酮二-O-葡萄糖苷（isoetin di-O-glucosides）。这些黄酮类化合物在亚族Hypochaeridinae的其他物种中也有检出。在所研究的分类群中，异艾黄酮衍生物仅以痕量化合物形式存在。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

黄酮类化合物（flavonoids）是植物中广泛存在的一类次生代谢产物，目前已报道的结构超过8000种。在植物体内，黄酮类化合物具有紫外线防护、活性氧（reactive oxygen species, ROS）清除、干旱/高温/冻害耐受以及信号分子等功能。异艾黄酮（isoetin，5,7,2′,4′,5′-五羟基黄酮）是一种较为罕见的黄酮（flavone），其生物合成途径尚未完全阐明，但化学上推测木犀草素（luteolin）可能是其生物合成前体。目前文献中仅报道了约30种异艾黄酮衍生物，其中约半数为其糖苷，其余为其甲醚。尽管异艾黄酮及其衍生物可见于水韭科（Isoetaceae）、毛茛科（Ranunculaceae）、蔷薇科（Rosaceae）和茜草科（Rubiaceae）等多个植物科中，但目前已知的分布与结构多样性中心之一是菊科（Asteraceae）的菊苣族（Cichorieae），尤其是Hypochaeridinae亚族。然而，在该亚族中，异艾黄酮及其衍生物并非主要黄酮成分，含量最高的通常是木犀草素及其衍生物，异艾黄酮衍生物仅以次要化合物形式存在。此前对菊苣族物种的研究表明，异艾黄酮衍生物主要分布于叶片中。

1978年Harborne首次报道了猫儿菊属（Leontodon）中存在异艾黄酮。近期，研究人员从硬毛猫儿菊叶片中分离得到一个此前未见报道的异艾黄酮衍生物，并通过高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）检测到更多疑似异艾黄酮衍生物的线索。这些发现提示硬毛猫儿菊及菊苣族其他近缘物种仍可能是发现新异艾黄酮衍生物的潜在来源。此外，异艾黄酮衍生物的有无可能构成区分属或种的化学表型标记（chemophenetic marker）。本研究旨在两种猫儿菊属物种中发现此前未见报道的异艾黄酮衍生物，并对猫儿菊属和猫儿菊亚族部分物种的提取物进行筛查，以考察所分离化合物在Hypochaeridinae亚族中的分布。

二、研究内容与主要结论

研究人员从硬毛猫儿菊叶片中分离得到化合物1-5及化合物7，从皱叶猫儿菊地上部分分离得到化合物6，共计七种黄酮糖苷。其中化合物1-5为已知化合物，化合物6和7为两种此前未见报道的异艾黄酮二-O-葡萄糖苷。通过高分辨质谱和核磁共振（NMR）数据与文献比对，化合物1被鉴定为木犀草素7-O-龙胆二糖苷（luteolin 7-O-gentiobioside），化合物2为木犀草素7,4′-二-O-葡萄糖苷（luteolin 7,4′-di-O-glucoside），化合物3为异艾黄酮7-O-β-d-吡喃葡萄糖基-2′-O-α-l-吡喃阿拉伯糖苷，化合物4为异艾黄酮7-O-β-d-吡喃葡萄糖基-2′-O-α-d-吡喃葡萄糖苷，化合物5为异艾黄酮2′-O-α-l-吡喃阿拉伯糖苷-5′-O-β-d-吡喃葡萄糖苷。

化合物6在负离子模式下显示准分子离子峰m/z 625.1377 [M-H]^-（C₂₇H₂₉O₁₇^?），分子式为C₂₇H₃₀O₁₇。MS/MS扫描显示两次162 Da的中性丢失。NMR数据与异艾黄酮二-O-葡萄糖苷衍生物的文献数据一致，两个吡喃葡萄糖基的端基质子耦合常数（J = 7.0和7.5 Hz）确定其均为β构型。HMBC数据中，δ_H 4.67 ppm的质子与δ_C 140.9 ppm的碳之间的交叉峰确定了其中一个β-吡喃葡萄糖基连接在异艾黄酮母核的5′位；另一个交叉峰（δ_H 4.94 ppm至δ_C 153.5 ppm）可归属于2′位或4′位。通过紫外光谱分析，在加入甲醇氢氧化钾溶液后，化合物6的带I发生红移且强度显著增加，与具有游离4′-羟基的黄酮糖苷参照物一致，因此确定第二个β-葡萄糖基连接在2′-O位。经水解和辛基化衍生化后通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，与d-葡萄糖和l-葡萄糖参照物比较保留时间，确定化合物6中的糖为d-葡萄糖。由此，化合物6的结构被确定为异艾黄酮2′,5′-二-O-β-d-吡喃葡萄糖苷，为一种此前未见报道的天然产物。

化合物7同样显示准分子离子峰m/z 625.1359 [M-H]^-（C₂₇H₂₉O₁₇^?），分子式同为C₂₇H₃₀O₁₇，MS/MS同样显示两次162 Da的中性丢失。由于获得的量较少且存在杂质，仅凭NMR无法确定精确结构。研究人员对化合物7的水解产物与异艾黄酮参照物（由化合物5经相同水解程序获得）及槲皮素参照物进行对比HPLC分析，其保留时间与异艾黄酮参照物一致。在室温下两个β-葡萄糖基与黄酮母核的连接无法明确确定，因此研究人员在328 K下额外测定了¹H NMR谱，两个葡萄糖基端基质子的双峰清晰可辨，HMBC数据中δ_H 4.45 ppm至δ_C 142.8 ppm的交叉峰确定了其中一个β-葡萄糖基连接在5′位；另一个交叉峰（δ_H 4.92 ppm至δ_C 155.4 ppm）可归属于2′位或4′位。室温下端基质子双峰部分未解析可能归因于两个β-葡萄糖基在空间上靠近所产生的位阻效应。紫外光谱分析显示，加入甲醇氢氧化钾溶液后化合物7的带I发生红移但强度未增加，与化合物6的变化显著不同，据此确定4′位被β-葡萄糖基取代。经水解、辛基化和GC-MS分析，确定糖为d-葡萄糖。由此，化合物7的结构被确定为异艾黄酮4′,5′-二-O-β-d-吡喃葡萄糖苷，同样为一种此前未见报道的天然产物。

研究人员进一步对Hypochaeridinae亚族中另外五种猫儿菊属物种和两种猫儿菊亚族物种（Hypochaeris属）的叶片提取物进行了半定量化学表型比较。结果表明，化合物3、4、5在所调查的所有物种中均有检出；化合物7在H. cretensis、H. radicata和L. tuberosus中未检出，但在所调查的其他猫儿菊属物种中均有检出。L. tuberosus属于猫儿菊属Thrinica组，而其他被调查的猫儿菊属物种属于Leontodon组或Asterothrix组。所有被定量的异艾黄酮衍生物均以低于0.5 mg/g干叶的痕量存在，而木犀草素衍生物在所有被调查物种中为主要黄酮成分。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要技术方法包括：植物材料取自德国基尔药学院植物园（N54°20′00.2″；E 10°06′57.4″；海拔31 m），硬毛猫儿菊种子来源于意大利伦巴第大区布雷西亚省Sonico镇Rino di Sonico的“Desert”地区（N 46°09′10.4″，E 10°21′29.9″，海拔740 m）；皱叶猫儿菊种子来源于意大利坎帕尼亚大区萨莱诺省的两个采集点（Monte Gelbison，N 40°12′57.8″，E 15°20′10.6″，海拔1660 m；Monte Faiatella，N 40°15′32.5″，E 15°28′04.3″，海拔1310 m）。提取分离采用丙酮及甲醇:丙酮:水（3:1:1）溶剂系统依次浸提，经液-液分配去除叶绿素，再经Sephadex LH-20凝胶排阻色谱和半制备高效液相色谱（semi-preparative HPLC）纯化。化合物结构鉴定采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS，配备Sciex X500R QTOF）、核磁共振波谱（NMR，包括¹H、¹³C、COSY、HSQC、HMBC，Bruker Avance 600）、紫外光谱分析（UV，用于判定4′-羟基是否被取代及B环邻二羟基是否存在）、酸水解结合辛基化衍生化后气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定糖的绝对构型。半定量分析以槲皮素为内标，按（分析物峰面积/槲皮素峰面积）× 0.893 mg × 2 g^?1计算各化合物含量。

四、研究结果分述

分离与结构鉴定结果：从硬毛猫儿菊叶片中分离得到化合物1-5和7，从皱叶猫儿菊地上部分分离得到化合物6。化合物1和2为木犀草素糖苷，化合物3-7为异艾黄酮糖苷，其中化合物6和7为两种此前未见报道的异艾黄酮二-O-β-d-吡喃葡萄糖苷，分别确定为异艾黄酮2′,5′-二-O-β-d-吡喃葡萄糖苷和异艾黄酮4′,5′-二-O-β-d-吡喃葡萄糖苷。

分布与化学表型比较结果：通过半定量分析，化合物3、4、5在所有被调查的猫儿菊属和猫儿菊亚族物种中均有检出；化合物7在H. cretensis、H. radicata和L. tuberosus中未检出，但在其他被调查的猫儿菊属物种中均有检出。所有异艾黄酮衍生物均以痕量（<0.5 mg/g植物材料，以槲皮素当量计）存在，而木犀草素衍生物为主要黄酮成分。此外，研究中还产生了多个化合物的新来源报道。

五、讨论与结论

本研究发现化合物3和4此前已在蒲公英属（Taraxacum）中有报道，但从未在猫儿菊属中报道；化合物6和7为全新化合物。这表明即使在研究较为充分的物种中，寻找新的异艾黄酮衍生物仍然是可行的。然而，这些化合物仅以痕量存在，所有被定量的异艾黄酮衍生物含量均低于0.5 mg/g干叶。其他酚类化合物如咖啡酰酒石酸和木犀草素7-O-β-葡萄糖苷在相应提取物中的含量则高得多。在所有被调查物种中，木犀草素衍生物是主要黄酮成分。

异艾黄酮及其衍生物在较高分类水平上不能作为化学表型标记，因为与其他多数黄酮类化合物一样，其在植物界的分布分散于不同且亲缘关系较远的分类群中。然而，菊苣族目前看来是异艾黄酮衍生物分布与多样性的主要中心，本研究进一步支持了这一观点。在被调查的Hypochaeridinae分类群中，化合物3、4、5在所有被调查物种中均出现。尽管生物样本量（n = 1）过小不足以得出一般性结论，但值得注意的是化合物7在H. cretensis、H. radicata和L. tuberosus的样本中未检出，而在所有其他被调查的猫儿菊属物种中均有检出。L. tuberosus属于猫儿菊属Thrinica组，而其他被调查的猫儿菊属物种属于Leontodon组或Asterothrix组，这一分布模式可能具有潜在的化学分类学意义。

研究结论：从硬毛猫儿菊和皱叶猫儿菊中共分离得到七种黄酮糖苷，其中化合物6（异艾黄酮2′,5′-二-O-β-d-吡喃葡萄糖苷）和化合物7（异艾黄酮4′,5′-二-O-β-d-吡喃葡萄糖苷）为两种此前未见报道的天然产物。这些异艾黄酮衍生物在Hypochaeridinae亚族中被调查物种中均以痕量存在，木犀草素衍生物为主要黄酮成分。本研究扩展了猫儿菊属中已知的异艾黄酮衍生物种类，并进一步支持菊苣族作为异艾黄酮衍生物分布与多样性中心的观点。