《Microbiology Research》：Analysis of Tap Water Quality in Victoria City, Tamaulipas, México, Using Traditional and Molecular Approaches to Identify Microorganisms
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自来水质量是重要的公共卫生问题，因为配水系统中的微生物污染可能对消费者构成风险。因此，本研究旨在整合传统方法与分子方法。传统方法，包括最可能数法（Most Probable Number, MPN）和选择性培养基，用于检测污染微生物指标；而使用聚合酶链反应（P
自来水质量是重要的公共卫生问题，因为配水系统中的微生物污染可能对消费者构成风险。因此，本研究旨在整合传统方法与分子方法。传统方法，包括最可能数法（Most Probable Number, MPN）和选择性培养基，用于检测污染微生物指标；而使用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）的分子分析用于鉴定城市配水网络内5个位点的Escherichia coli。基于微生物持续存在和资源限制，在5个位点中的两个进行了宏基因组分析。测序用于表征培养方法可能无法检测的更广泛微生物群落。传统分析揭示耐热大肠菌群的存在，提示潜在粪便污染，而PCR确认Escherichia coli的存在。宏基因组分析鉴定出多样化细菌群落，其中莫拉菌科（Moraxellaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）为主要分类群。传统与分子方法的联合使用为评估自来水质量和具有潜在卫生学重要性的细菌分类群提供了互补信息。
研究背景方面，安全饮用水是人类基本需求，但细菌污染、环境因素和高人口增长导致水资源持续稀缺和退化。不完善的水基础设施和监测不足可损害安全自来水获取，并增加包括重金属在内的化学污染物暴露风险，这些污染物与不良健康效应和慢性暴露相关。此外，自来水供应的粪便污染可导致致病微生物存在，引起胃肠道和其他感染性疾病，包括腹泻、胃肠炎、甲型肝炎、痢疾、脊髓灰质炎和伤寒。当前水质受工业过程、农业实践、家庭活动和畜牧业等人类活动强烈影响。约三分之一胃肠道疾病与消费污染自来水有关，2019年至少导致140万人死亡。因此，微生物技术对评估自来水质量至关重要，其中MPN法广泛用于通过系列稀释估计可存活微生物种群，并检测粪便指示菌，包括粪大肠菌群（fecal coliforms, FCs）、Enterococcus spp.和Escherichia coli。然而，研究指出以这些病原体群作为指示菌存在疑问，因为这些细菌可在无宿主条件下繁殖和持续存在。MPN法的局限在于仅检测在培养基条件下生长的微生物，从而排除其他微生物物种。Endo LES琼脂用于识别指示粪便污染的细菌，但也可能抑制其他微生物生长。由于传统微生物检测方法的局限，测序技术发展促进了更准确监测方法的发展。PCR是高度特异和敏感的分子方法，可检测低浓度微生物靶标。宏基因组分析通过识别功能基因和测序，能够表征、检测和分类鉴定样品中微生物，以理解水网络中的微生物多样性。然而，专门针对自来水系统的研究存在明显空白，因为多数研究仅关注MPN和菌落形成单位（Colony Forming Unit, CFU）等传统方法，而这些方法不能全面了解饮用水细菌多样性。中国杭州的分子方法研究检测到传统培养方法无法识别的不可培养微生物，如Proteobacteria成员。墨西哥研究用传统微生物方法评估自来水质量，例如Guadalajara城和墨西哥州研究报告水质超过基于MPN的允许限值。相反，宏基因组方法已在Tijuana应用，主要用于研究配水管道中与生物膜相关的微生物群落。不幸的是，在Tamaulipas州，尚无研究使用传统或分子方法分析配水网络饮用水。需强调，整合这些方法可提供微生物质量和细菌多样性的互补信息。例如，美国研究显示传统与分子方法联合应用可检测潜在致病菌，包括Klebsiella pneumoniae和Pseudomonas aeruginosa，这些细菌不一定总能通过常规监测方法检测到。然而，分子技术也存在显著局限，其应用需要专门设备和大量财务资源，尤其使用测序方法时。此外，分子分析可能需要补充下游实验以进一步表征或确认检测微生物的生物学相关性。这些局限可限制可分析样品数量和可进行补充分析的范围。总之，本研究目标是整合传统微生物检测方法与分子方法，以获得墨西哥Tamaulipas州Victoria城管道分配饮用水微生物质量的全面概况。
研究人员开展研究，得出结论并具有重要意义。研究区域位于墨西哥Tamaulipas州Victoria市城市区。饮用水采样点分布在全市，包括服务城市水网络主要配水支线的饮用水泵站。这些位点因高体积流量217 m
3/hour而选择，为大量家庭和商业供水。位点S3代表水渠上的战略监测点，其取水口位于Vicente Guerrero Dam，该系统供应Victoria城公共供水总量的46%。S1、S2、S4和S5对应散装水配水点，位于有支线的区域，供水由深井水补充，并最终通过供应饮用水网络主要部门的支线与Vicente Guerrero Dam水混合。采样于2024年10月至2025年1月在Victoria城城市区进行。每月从每个选定位点采集一个样品，共24个样品。20个样品用于传统微生物分析，4个额外样品专门用于宏基因组分析。样品在4 ± 2 °C运输，并在同温度冷藏保存，所有样品在采集后24 h内于墨西哥国家技术学院Victoria城校区生物技术实验室分析。样品采集和分析依据NMX-AA-042-SCFI-2015墨西哥标准，以确保验证过程和可重复性。
为开展研究，研究人员采用的主要关键技术方法包括：在Victoria城5个位点于2024年10月至2025年1月每月采样，共获得24个自来水样品，其中20个用于传统微生物分析，4个用于宏基因组分析；传统方法使用MPN法和m-Endo LES选择性鉴别培养基；分子方法使用常规PCR扩增细菌16S rRNA基因，并以限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）和Hae III酶切分析；宏基因组分析在S1和S2进行，使用Illumina MiniSeq平台测序16S rRNA基因V4区，并进行生物信息学分类和Alpha多样性分析。样本来源为Victoria城城市区饮用水配水网络，包括泵站和配水点，S3取水口位于Vicente Guerrero Dam。
研究结果如下。3.1 MPN：根据NOM-127-SSA1-2021，耐热大肠菌群最大允许限值为<1.1 MPN/100 mL，即不可检出。结果表明，采样点S1、S2、S4和S5超过饮用水质量允许限值；S3在11月至1月期间符合允许限值，未检测或回收到高于方法检测限的可培养细菌，但10月超过允许限值。通过MPN培养得出上述结论。
3.2 m-Endo LES Agar：使用ENDO琼脂分析20个样品以推定检测微生物，其中13个自来水样品推定检测到E. coli。培养皿显示Escherichia coli生长特征，呈暗红色菌落并带金属光泽。根据NOM-127-SSA1-2021，每100 mL分析样品中大肠菌群必须不存在。推定检测频率因采样点而异：S1和S2最高且最一致，在4个月采样中为100%；S3和S4最低，各为25%；S5为75%。通过选择鉴别培养基推定检测得出。
3.3 Conventional PCR：使用针对细菌16S rRNA基因的通用引物扩增来自Endo琼脂培养的E. coli菌落DNA。E. coli TOP 10 F′作为阳性对照，来自三个DNA样品的扩增子为预期996 bp。通过常规PCR确认E. coli存在。
3.4 RFLP：PCR扩增后，使用Hae III限制酶对扩增产物进行RFLP分析，并在8%聚丙烯酰胺凝胶中电泳。根据消化产物条带模式和分子量估计，将每个微生物分类到特定组或属。通过RFLP分析得出。
3.5 Bacterial Diversity by Metagenomics：基于传统微生物和PCR分析显示E. coli阳性，选择S1和S2进行宏基因组分析。由于财务和资源限制，宏基因组测序仅限于这些样品。使用Illumina流程获得结果，DADA2流程未用于进一步分析，因为其仅提供科水平分类分辨率。细菌鉴定总可用reads为230,134，平均57,534 reads。S1 reads最高，为95,470；S2最低，为14,898。主要门为Proteobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes。处理水样品S1和S1.1含Moraxellaceae、Pseudomonadaceae和Chromatiaceae，为最丰富三科。S2具有相似细菌组成，包括Streptococcaceae和Caulobacteraceae。Enterobacteriaceae在S1、S1.1和S2中丰度较高。S2.1中Pseudomonadaceae为优势科，而Sphingomonadaceae和Streptococcaceae丰度较低。通过16S rRNA宏基因组测序得出。
3.6 Alpha Diversity：S1.1呈现最高观测独特分类群丰富度。根据Shannon和Simpson指数，S2分别显示最高多样性和优势度。总体而言，分析样品显示低至中等多样性。Chao1估计表明，分析样品未捕获细菌群落的全部估计丰富度。本研究鉴定286个操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）。样品间各分类群比较显示，S1中优势属为Serratia；S1.1中Alkanindiges相对丰度最高；S2以Lactococcus最丰富；S2.1中Paracoccus、Pseudomonas、Blastomonas、Corynebacterium、Stenotrophomonas和Novosphingobium最普遍。归一化数据表明S2.1具有与S2、S1.1和S1不同的微生物群落。Pseudomonas在S2.1中高度普遍，而Acinetobacter在所有样品中保持丰富。通过Alpha多样性指数和OTU相对丰度得出。
讨论部分总结：饮用水微生物分析已从传统培养方法发展到先进分子方法，提高检测范围、灵敏度和特异性。整合本研究技术代表评估饮用水质量的全面稳健策略。MPN因低成本和简单性被国家和国际法规广泛采用，用于检测总大肠菌群和粪大肠菌群，但仍有限制，包括长孵育时间和假阳性可能，因为一些非大肠菌群细菌可发酵乳糖。本研究中MPN提供在特定方法条件下可产生可检测培养反应的可存活微生物估计，但该方法不测量E. coli在整个群落中的相对丰度。根据结果，水质超过允许限值，表明存在耐热大肠菌群，总体而言这是公共卫生保护关注点。研究结果与厄瓜多尔社区观察一致，当地饮用水显示9至20 MPN/100 mL的大肠菌群高微生物密度，超过同一法规标准允许限值。m-Endo Agar LES使用通常受若干技术局限限制：不支持某些革兰阴性菌的有效生长，且不能完全抑制所有革兰阳性菌。然而，它作为推定检测E. coli的高效直接检测培养基。本研究中在m-Endo agar LES上检测到13个具有特征形态的推定培养物，支持其作为后续分子确认的筛选培养基。此前研究报告m-Endo agar LES与选择性培养基Deoxycholate Agar相比可检测65%的E. coli。因此，常规PCR应用显示高效，可同时检测饮用水中多种病原菌，检测准确率高达94%。本研究中，通过使用Hae III限制酶和Escherichia coli TOP10 F’菌株作为PCR和RFLP阳性对照，成功鉴定Escherichia coli。这些方法与在中国检测饮用水中E. coli的研究一致。然而，终点PCR不能区分死菌和活菌，可能导致微生物风险高估。相反，靶向mRNA的逆转录PCR可提供细菌活性补充信息；但在本研究中，由于财务限制无法进行该技术。宏基因组仅用于两个位点S1和S2，以表征这些位置细菌多样性，并评估传统方法未能检测的其他相关微生物共存。Simpson指数值为0.4347至0.7155，Shannon指数值为1.4732至2.0676。两个指数显示的值与其他供水网络研究报道相似。本探索性研究仅使用16S rRNA基因V4区。该低成本方法使用MiniSeq平台，可产生与MiSeq平台相当的高质量测序结果。然而，该区域获得的分辨率主要限于科水平；使用V2-V3或V3-V4等其他16S rRNA区域可能提供更高分类分辨率。本研究未评估Zymo Research Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit效率。该方法基于先前研究选择，这些研究评估其在饮用水样品中的使用并报道高质量DNA。本研究中DNA提取和16S rRNA分析证明其在回收细菌DNA用于Illumina测序方面的有效性。本研究提出的方法可能作为有用补充策略，促进未来饮用水监测研究。尽管如此，研究人员检测到286个OTUs，包括在S2.1中高度丰富的Pseudomonas，以及在S1.1中非常低丰度的Moraxella。虽然该地区未明确报告暴发，但Pseudomonas与肺炎、败血症和皮肤感染相关。同时，Moraxellaceae成员与尿路、肺和伤口感染相关。这些发现表明微生物多样性，但不确认可存活致病菌种存在。相反，Staphylococcaceae仅在未处理水样品S2中检测到，处理后未检测到。该科成员常在原水系统以及环境和淡水样品中报道。然而，本研究中宏基因组分析未检测到E. coli，可能由于样品复杂性、低丰度以及生物信息学分析技术限制，包括测序深度，可能影响低丰度E. coli序列检测。这可解释为何Escherichia coli在宏基因组研究中常被低估甚至缺失。例如，就相对丰度而言，E. coli仅通过培养方法检测到，而宏基因组分析在其占总reads约0.002%时未检测到，该非常低相对丰度可能低于方法检测限。另一促进因素是不足测序深度。换言之，可靠检测和鉴定Escherichia coli，即使低丰度，也需要高reads数量和足够read长度以确保其在数据集中适当呈现。为实现可靠检测，可能需要约1%相对丰度阈值，进而需要约3000万reads或更多测序深度，以15×覆盖度自信检测Escherichia coli。根据该方法，检测E. coli约需300,000 reads。本研究中总共获得230,134可用reads；因此，测序深度也可能限制E. coli检测。更高测序深度和其他16S引物组合可能改善该物种鉴定。此外，重要考虑是细胞过滤、DNA提取和文库制备步骤中引入偏差，这些步骤对分离和处理细菌DNA至关重要。因此，有多种试剂盒和方法可用。本研究实施程序检测到S2中潜在致病微生物可能存在，该采样点是深井水和Vicente Guerrero Dam水混合处。因此，该位点对监测水源和评估水质重要。本研究也存在若干局限。
结论翻译：本研究具有高度相关性，因为研究区域没有结合传统和分子技术的记录或类似研究。研究人员使用传统方法在自来水样品中检测到粪便污染指标，而PCR确认Escherichia coli的存在。此外，研究人员观察到Victoria自来水中多样化细菌分类群，这些位点基于微生物持续存在和资源限制选择。然而，这些结果应解释为微生物多样性证据和未来监测活动的探索性证据，而非确认致病菌种存在或其在整个Victoria城配水网络中的存活性。因此，其余采样点的微生物多样性可能未完全表征，需要进一步宏基因组分析以全面评估和监测这些位点的微生物多样性。本研究结果可通过证明传统微生物方法和分子工具提供互补信息，帮助加强当地自来水微生物监测。宏基因组可能特别有用于在有微生物风险证据或水质变化的地点表征微生物多样性。
