人类脊髓类器官重现少突胶质细胞谱系的发育与疾病相关特征

《Stem Cell Reports》：Human spinal cord organoids recapitulate developmental and disease-associated oligodendrocyte lineage signatures

少突胶质细胞在中枢神经系统发育和稳态维持中发挥重要作用，其功能障碍是多种神经系统疾病的标志。然而，支持少突胶质细胞谱系进展并同时能够研究疾病相关状态的人类体外系统仍然有限。本研究建立了人类脊髓类器官（human spinal cord organoids, hSpO）和皮质-运动神经元组装体（cortico-motor assembloids）作为模型平台，用于模拟少突胶质细胞发育、神经元-胶质细胞相互作用以及细胞因子诱导的功能障碍。研究结果表明，hSpO能够产生在转录水平上类似于发育中人类脊髓的少突胶质细胞谱系群体，并且少突胶质祖细胞（oligodendrocyte progenitor cells, OPCs）表现出生理相关行为，包括迁移和单突触神经元输入。将组装体暴露于促炎细胞因子可诱导少突胶质细胞谱系发生转录变化，其特征为谱系进展改变以及获得与多发性硬化（multiple sclerosis, MS）患者组织中观察到的特征相一致的疾病相关基因表达程序。综上所述，本研究建立了hSpO和组装体作为在人类多细胞背景下研究少突胶质细胞谱系发育和疾病相关状态的体外系统。

论文解读：人类脊髓类器官重现少突胶质细胞谱系的发育与疾病相关特征

一、研究背景与科学问题

少突胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system, CNS）功能与稳态的关键调节者。除髓鞘形成和跳跃式传导这一经典功能外，少突胶质细胞还为神经元提供代谢支持和离子调节。少突胶质细胞起源于少突胶质祖细胞（oligodendrocyte progenitor cells, OPCs），后者具有多种功能角色，包括突触形成、突触精修和免疫调节，并且是成人CNS中数量最多的分裂细胞。少突胶质细胞和OPCs均已被证明参与多发性硬化（multiple sclerosis, MS）、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）和肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等神经系统疾病的发生和进展。它们可能成为最早受影响的细胞，呈现炎症表型，并通过支持功能丧失和获得疾病样状态双重机制促进疾病进展。然而，由于缺乏能够捕获早期病理变化、超越尸检组织的实验上可操作的人类系统，少突胶质细胞谱系在生理和疾病相关状态下的机制仍知之甚少。此前研究人员已开发了人类脊髓类器官（hSpO），可利用人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）重现人类脊髓/后脑的神经元多样性。hSpO可与其他区域特异性类器官（包括人类皮质类器官hCO和人类骨骼肌类器官hSkM）组装，形成功能整合的组装体，模拟皮质-脊髓-肌肉轴的突触连接。然而，这些组装体中少突胶质细胞谱系的详细特征、功能及其对损伤的反应仍未探索。因此，本研究旨在建立hSpO作为研究人类少突胶质细胞谱系生物学的平台。

二、研究内容与主要结论

研究人员建立了hSpO作为研究人类少突胶质细胞谱系生物学的平台，证明了hSpO和组装体来源的少突胶质细胞谱系细胞能够重现人类胎儿脊髓群体，并表现出生理相关行为，包括向缺乏少突胶质细胞的组织迁移以及与神经元的直接突触连接。此外，研究人员建立了模拟少突胶质细胞疾病相关特征的实验范式，证明细胞因子诱导的促炎环境驱动少突胶质细胞状态转变，其特征为谱系平衡改变和免疫相关基因表达的获得，与原发性人类样本中观察到的反应相似，并类似于MS患者组织中的少突胶质细胞疾病特征。

三、关键技术方法

本研究涉及多项关键技术方法。样本来源包括三条hiPSC系（8858-1、C4-1和0524-1）以及人类胎儿皮质组织（孕周18-20周，n=3个独立样本）。主要技术方法包括：hSpO和hCO-hSpO-hSkM组装体的三维培养体系；批量RNA测序（bulk RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq，10× Chromium平台）；O4抗体免疫淘选（immunopanning）富集少突胶质细胞谱系细胞；慢病毒介导的SOX10谱系特异性标记（LV-SOX10-GFP和LV-SOX10-Cre）；改良狂犬病毒介导的单突触逆行示踪；TNF-α、IL-1α和C1q（TIC）细胞因子处理；Luminex多因子细胞因子释放检测；以及基于Seurat和Harmony等工具的生物信息学分析。

四、研究结果

hSpO中的少突胶质细胞谱系：通过批量RNA-seq分析，研究人员发现SOX10、PDGFRA和MAG等少突胶质细胞谱系特异性标志物随培养时间增加并在第120天趋于稳定。免疫组化证实了SOX10+细胞、OPCs（PDGFRA+）和成熟少突胶质细胞（MBP+）的存在。通过scRNA-seq，研究人员鉴定了七个高质量细胞簇，包括循环OPCs（Cyc OPC）、OPC1、OPC2、定型少突胶质前体细胞（COP）、新形成少突胶质细胞（NFOL）、髓鞘形成少突胶质细胞（MFOL）和成熟少突胶质细胞（MOL）。利用人类胎儿脊髓数据集（孕周17-18周）进行标签转移验证了细胞类型身份。组装条件不影响整体谱系进展，但hCO-hSpO-hSkM中多能胶质祖细胞（mGPC）比例较单独hSpO有所增加。

hSpO中少突胶质细胞谱系细胞行为的表征：研究人员利用LV-SOX10-GFP标记少突胶质细胞谱系细胞并与缺乏少突胶质细胞的hCO组装，观察到SOX10-GFP细胞在两周内显著迁移进入hCO，证实了OPCs的迁移能力。通过改良狂犬病毒单突触示踪系统，研究人员证实了神经元与少突胶质细胞谱系细胞之间存在直接的单突触连接。在缺乏G蛋白的情况下，GFP标记主要限于起始细胞（mCherry+GFP+），而递送G蛋白后mCherry-GFP+细胞增加13倍，表明存在稳健的逆行标记。约90%的突触前细胞共表达神经元标志物MAP2，证实神经元在hSpO中与少突胶质细胞谱系细胞形成单突触连接。

神经炎症诱导的谱系破坏建模：研究人员用TIC处理hCO-hSpO-hSkM组装体8周，发现TIC处理的星形胶质细胞确实表现出反应性特征，上调C3、LCN2、GFAP、CHI3L1和APOE等已知反应性基因。在少突胶质细胞谱系中，TIC处理增加了增殖性细胞簇的代表性并降低了最成熟MFOL/MOL簇的比例。TIC处理的样本还表现出增殖标志物TOP2A和MKI67表达升高，以及MFOL/MOL标志物MOG和OPALIN表达降低。为验证这些表型的生物学相关性，研究人员从人类胎儿皮质组织（孕周18-20周）免疫淘选O4+少突胶质细胞谱系细胞进行2D培养，TIC处理14天后MBP表达降低约15倍，证实类器官反应与原发性人类组织一致。

疾病相关特征的获得：基因本体（GO）富集分析显示，TIC处理的少突胶质细胞上调了DNA损伤反应、蛋白酶体功能、mTORC1信号调节和胰岛素反应性相关通路，同时下调氧化磷酸化、mRNA加工和翻译以及胆固醇生物合成通路。成熟MFOL/MOL细胞中乳酸转运体MCT1（SLC16A1）表达降低，胆固醇合成相关基因也下调。与MS患者数据集比较发现，MS特异性少突胶质细胞簇Oligo_G中上调基因的42%也在TIC处理的少突胶质细胞谱系细胞中上调，共享基因包括DNAJC1、NFASC和STAT3。TIC处理还诱导了主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类基因的稳健表达，其中OPCs中表达最高，免疫组化在蛋白水平上证实了MHC I类表达与O4+少突胶质细胞谱系细胞的广泛共定位。在人类胎儿少突胶质细胞富集培养中，TIC和IFN-γ处理分别使MHC I类表达少突胶质细胞增加4倍和10倍，MHC II类表达分别增加13倍和29倍。Luminex检测显示，TIC处理的组装体释放了多种炎症介质，包括IFN-γ、IL-6和IL-1β。

五、讨论与结论

本研究表明hSpO和组装体支持少突胶质细胞谱系的多个阶段，并能够研究历史上难以在人类多细胞环境中探索的发育和病理过程。与以往侧重于产生和检查成熟髓鞘形成少突胶质细胞的研究不同，本研究强调OPC行为和全谱系对疾病环境的转录反应。谱系进展在不同培养环境中保持，表明少突胶质细胞维持其内在分化程序。研究首次在体外人类系统中证明了神经元-少突胶质细胞突触连接，并引入了研究这些相互作用的病毒策略。在细胞因子诱导的神经炎症条件下，少突胶质细胞表现出与应激反应和疾病相关状态一致的转录变化，包括乳酸转运和胆固醇生物合成等关键稳态功能程序的丧失。炎症暴露与OPC增殖增加和成熟样少突胶质细胞代表性降低相关，这一模式在MS、ALS和脊髓损伤等多种神经系统疾病中均有报道。少突胶质细胞还获得了免疫样特征，包括MHC I类和II类分子上调，与人类MS组织和动物模型中报道的疾病相关少突胶质细胞状态一致。虽然细胞因子处理的少突胶质细胞不能完全重现成人MS转录特征，但疾病相关标志物的诱导凸显了该系统用于模拟早期炎症驱动的病理状态的实用性。研究局限性包括类器官缺乏体内空间组织和区域特化、少突胶质细胞谱系主要代表发育状态、微胶质细胞缺失以及髓鞘形成尚未在组装体中探索。未来研究将利用该系统研究疾病相关少突胶质细胞状态如何影响区域特异性神经元群体和肌肉收缩，特别关注运动神经元功能。