《Stem Cell Reports》：Characterization of structural variants in KOLF2.1J iPSCs and their potential impact on forebrain organoid differentiation
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KOLF2.1J人诱导多能干细胞（iPSC）系被建立为神经系统疾病建模的参考细胞系。既往基因分型研究已鉴定出数个大型结构变异（SVs），引发了关于其对神经元分化潜在影响的疑问。本研究通过长读长测序（LRS）和光学基因组图谱（OGM）技术，额外鉴定出37个结构变
KOLF2.1J人诱导多能干细胞（iPSC）系被建立为神经系统疾病建模的参考细胞系。既往基因分型研究已鉴定出数个大型结构变异（SVs），引发了关于其对神经元分化潜在影响的疑问。本研究通过长读长测序（LRS）和光学基因组图谱（OGM）技术，额外鉴定出37个结构变异。此外，研究人员发现其中一个已知的结构变异包含一个此前未检测到的与RYBP基因（一种神经发育相关基因）的重叠区域。为评估这些结构变异的功能后果，研究人员对来源于KOLF2.1J及两个独立对照iPSC细胞系的第90天前脑类器官进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。虽然细胞类型组成得以保留，但多个受结构变异影响的基因存在差异表达，且KOLF2.1J类器官中细胞-细胞黏附和突触相关过程显著富集。这些发现强调了可靠的基于iPSC的建模中，稳健的遗传特征鉴定和多细胞系验证的重要性。
**KOLF2.1J iPSC中结构变异的全面鉴定及其对前脑类器官分化的功能影响——论文深度解读**
**一、研究背景与科学问题**
诱导多能干细胞（iPSC）衍生的培养体系，包括二维（2D）单层培养和三维（3D）类器官，已成为研究人类发育和模拟多种组织疾病的重要工具。然而，iPSC细胞系的衍生过程及不同分化方案的应用可能引入细胞发育的变异性，影响实验结果的一致性并限制跨研究标准化。KOLF2.1J是一种克隆人诱导多能干细胞（hiPSC）系，经CRISPR/Cas9编辑修复了ARID2基因的致病性突变，旨在作为阿尔茨海默病及相关痴呆症建模的参考细胞系。iPSC神经退行性疾病倡议（iNDI）联盟为此投入了大量质量控制工作，确保该细胞系无有害突变、具备神经分化能力且基因编辑后保持遗传稳定性。
此前的Illumina高密度单核苷酸多态性（SNP）芯片检测在KOLF2.1J中鉴定出5个杂合结构变异（SVs），包括3个杂合缺失和2个杂合重复，大小范围为132至766 kb。其中影响JARID2、DTNBP1（6p22.3缺失）和ASTN2（9q33.1缺失）的变异与神经发育障碍相关。然而，SNP芯片的分辨率有限，且KOLF2.1J作为广泛使用的参考细胞系，其基因组仍缺乏全面高分辨率的特征解析。该研究的开展旨在通过长读长测序（LRS）和光学基因组图谱（OGM）技术，对KOLF2.1J进行更全面的结构变异鉴定，并评估这些变异对前脑类器官（FOs）分化的功能影响。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员采用PacBio HiFi长读长测序技术对KOLF2.1J第4代细胞进行基因组分析，利用相位组装变异（PAV）调用器鉴定结构变异，同时使用Bionano OGM技术对第30代细胞进行正交验证。通过两技术平台的交叉验证，研究人员最终聚焦于41个位于非节段重复区域的、经VEP预测为高影响的、且在群体数据库中缺失的稀有结构变异。研究进一步通过qPCR验证了四个受SV影响的基因（DTNBP1、JARID2、RYBP、ASTN2）在KOLF2.1J iPSC中的表达显著降低。随后，研究人员对来源于KOLF2.1J及两个独立对照细胞系（BIONi010-C和HMGU1）的第90天前脑类器官进行单细胞RNA测序，系统评估这些结构变异对神经分化的功能影响。研究结果表明，KOLF2.1J细胞系整体基因组稳定，未快速累积有害结构变异；其前脑类器官的细胞类型组成和神经发育轨迹与对照细胞系一致，但存在多个SV相关基因的差异表达以及细胞黏附和突触相关通路的富集。
**三、关键技术方法**
本研究采用了多种互补的高分辨率基因组分析技术。长读长测序方面，使用PacBio HiFi平台对KOLF2.1J第4代细胞进行测序，并通过HiFiasm组装和PAV调用器进行SV鉴定。光学基因组图谱方面，使用Bionano Saphyr平台对第30代细胞进行超高分子量DNA标记与成像，通过Bionano Solve软件进行引导组装。单细胞RNA测序方面，对第90天前脑类器官（每细胞系3个类器官）进行10x Genomics 3′单细胞测序，并使用Cell Ranger、Scanpy、Seurat等工具进行下游分析。此外，研究还应用了Ensembl Variant Effect Predictor（VEP）进行SV功能注释，使用qPCR进行基因表达验证。对照细胞系包括BIONi010-C（来源：EBiSC）和HMGU1（来源：Helmholtz Zentrum München）。
**四、研究结果**
**1. 使用PacBio LRS鉴定KOLF2.1J中的SV**
研究人员使用PacBio HiFi测序生成第4代细胞的基于组装的变异调用，通过PAV调用器共鉴定出27,665个SV（以GRCh38为参考），包括16,942个插入、10,483个缺失、92个倒位和148个重复。以T2T-CHM13v2.0为参考时鉴定出38,909个SV。倒位因难以验证且不太可能导致基因剂量改变而被排除。最终聚焦于1,974个≥2 kb的SV进行正交验证。
**2. 使用Bionano OGM进行SV调用的正交验证**
Bionano OGM分析（第30代）以hg38为参考共鉴定出1,790个SV（973个插入、614个缺失、141个倒位、62个重复）。两种技术在≥2 kb的SV中共享1,064个调用（LRS的53.9%和OGM的64.5%），其中缺失的一致性最高（64.9%），插入次之（52%），重复最低（5.2%）。150个高影响变异中有65个获得两种技术支持，其中2个因位于着丝粒周围区域且大小超过1 Mbp被排除。
**3. SV的潜在效应**
63个LRS和OGM支持的SV被鉴定为高影响VEP结果且不存在于群体数据库中，涉及120个基因。其中22个主要位于节段重复区域，其余41个位于非SD位点。值得关注的是，OGM和LRS数据揭示此前报道的3p13.2 SV导致RYBP基因第3和4外显子缺失，表明该缺失实际比先前描述的更大，其5′断点位于RYBP内部。
**4. qPCR验证SV对iPSC基因表达的影响**
研究人员对KOLF2.1J（第17、18、19、29代）和对照SUSL25细胞系中四个SV重叠基因（DTNBP1、JARID2、RYBP、ASTN2）进行qPCR分析。结果显示四个基因均显著下调，平均倍数变化分别为DTNBP1 0.598倍（降低约40%）、JARID2 0.650倍（约35%）、RYBP 0.515倍（约49%）、ASTN2 0.556倍（约44%），证明相应缺失对基因表达存在一致性影响。
**5. 评估KOLF2.1J的SV对FO分化的潜在影响**
对第90天前脑类器官进行单细胞RNA测序，通过FOXG1表达确认前脑区域身份，共鉴定出12个不同细胞群体，包括放射状胶质细胞/外层放射状胶质细胞（RG/oRG）、循环祖细胞（Cyc Prog）、未成熟抑制性中间神经元（iINs）、FOXP1+和FOXP2+未成熟抑制性投射神经元（iPNs）、Cajal-Retzius神经元（CRNs）、中间前体细胞（IPCs）、新生和成熟胼胝体投射神经元（CPNs）、皮质投射神经元（CFuPNs）及FOXG1低表达神经元群。细胞组成和伪时间分析显示各细胞系间无显著差异，表明分化同步性良好。
**6. 差异基因表达分析与蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络**
KOLF2.1J特异性的差异表达基因（DEGs）分析显示，iINs和FOXP2+ iPNs的DEG数量最多。四个SV影响基因差异表达：DTNBP1（在CPNs、CFuPNs和FOXP1+ iPNs中下调）、GSTT2B（在iINs、FOXP2+ iPNs和Cyc Prog中下调）、GSTM2（在iINs和FOXP2+ iPNs中上调）和ASTN2（在iINs中上调）。基因本体（GO）分析将KOLF2.1J特异性DEGs关联到离子运输、突触组装和细胞间黏附。基因集富集分析（GSEA）证实了这些发现，并显示iINs中细胞质翻译和核糖体生物发生负富集。STRING PPI网络分析显示高置信度相互作用稀疏且主要为单向。CellChat分析显示推断的细胞间接触相互作用总数和强度在各细胞系间一致，尽管KOLF2.1J表现出较弱的突触信号，但GABA能和谷氨酸能信号得以保留。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，KOLF2.1J作为广泛使用的参考iPSC系含有可能影响神经元基因表达的SVs。LRS和OGM数据来自不同代数（第4代和第30代），但两数据集间差异SV很少，表明细胞系整体稳定。LRS和OGM的关键优势在于更精确地解析SV断点和检测SNP芯片无法识别的较小变异，如3p13.2缺失与RYBP基因重叠的发现。RYBP是PRC1复合物组分，参与组蛋白H2A泛素化，其剂量降低与神经分化受损、神经祖细胞扩增、树突复杂性降低和Notch信号改变相关。尽管KOLF2.1J适用于FO研究，特别是细胞类型组成和发育轨迹相关研究，但其类器官表现出不成比例的高DEG数量，包括四个SV影响基因的异常表达。DTNBP1和ASTN2在神经元运输、迁移和突触功能中具有明确作用，是观察到的突触和黏附相关转录变化的可能贡献者；而GSTT2B和GSTM2作为谷胱甘肽S-转移酶家族成员，其表达改变可能反映代偿或应激缓冲反应。
研究结论翻译：总体而言，我们的研究结果强调，全面的基因组分析对于准确解读细胞表型和神经分化中的细胞系特异性变异至关重要。虽然KOLF2.1J仍适用于FO研究，但该细胞系及其他参考iPSC系应结合其各自的变异谱进行考量，其表型后果可能因发育背景、细胞谱系和检测灵敏度而异。研究人员强调使用多细胞系进行可靠的iPSC建模的重要性，并展望LRS、OGM及未来的端粒到端粒测序技术将成为参考iPSC特征鉴定的金标准，确保耗时且资源密集的分化方案在具有生理相关性的细胞系上开展。
