Zerumbone通过抑制TRPV1介导的离子电流降低人iPSC来源的伤害感受器样神经元兴奋性及其对TRESK通道的浓度依赖性调节

《Molecular Pain》：Zerumbone alleviates TRESK- and TRPV1-mediated ion currents and reduces excitability of human iPSC-derived nociceptor-like neurons

　　

摘要专业翻译 次级植物代谢物广泛应用于传统医学和自然疗法中以治疗疼痛、感染和炎症。来源于可食用生姜植物Zingiber zerumbet的倍半萜类化合物Zerumbone已在临床前模型中显示出镇痛、抗氧化、抗肿瘤和抗菌作用，其作用通过多种受体系统介导，包括大麻素（CB）受体、过氧化物酶体增殖物激活受体、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体以及血清素能系统。Zerumbone还调节与抗异常性疼痛反应相关的炎症和NO–cGMP–K+ATP信号通路，但其对伤害感受器相关离子通道（如瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）和脊髓双孔钾通道（TRESK））在人类细胞系统中的直接影响仍缺乏表征。在本研究中，研究人员在人类HEK293细胞和诱导多能干细胞（iPSC）来源的伤害感受器模型中研究了Zerumbone的抗伤害感受特性。研究发现，Zerumbone处理以浓度依赖性方式降低细胞活力和增殖，但不改变TRPV1或TRESK的蛋白表达。全细胞膜片钳记录显示，直接应用Zerumbone可逆地抑制TRESK介导的外向钾电流，而通过灌流液给予Zerumbone则增加外向电流，提示其调节具有情境依赖性。在表达TRPV1的HEK293细胞、SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和人iPSC来源的伤害感受器中，Zerumbone降低了TRPV1介导的离子电流和辣椒素诱发的钙信号，表明其对TRPV1活性具有直接或竞争性抑制作用。在iPSC来源的伤害感受器中，Zerumbone在中等去极化电流下降低了动作电位发放频率，改变了静息膜电位，并增加了基强度电流，与伤害感受器兴奋性降低一致，但未检测到TRESK介导电流的显著变化。这些数据表明，Zerumbone主要通过抑制TRPV1来减弱人iPSC来源的伤害感受器样神经元的兴奋性，而对TRESK的调节则更为复杂，且依赖于浓度和应用方式。这些发现为Zerumbone在啮齿动物模型中观察到的抗异常性疼痛效应提供了机制基础，并强调需要在人类来源系统中开展进一步研究，以阐明精确的通道水平相互作用及其与炎性疼痛和神经病理性疼痛的相关性。

论文解读

一、研究背景与意义

次级植物代谢物在传统医学和自然疗法中被广泛用于缓解急性和慢性疼痛、治疗感染或退热。Zingiber zerumbet是一种原产于热带地区的可食用野生姜科植物，在亚洲医学中有着悠久的抗感染和镇痛应用历史。从中提取的倍半萜类化合物Zerumbone已在多种啮齿动物疼痛模型中显示出镇痛活性，且仅在较高剂量下表现出毒性。此外，Zerumbone还被认为是一种多功能化合物，具有抗氧化、抗肿瘤和抗菌特性。

Zerumbone的镇痛作用涉及多种受体系统，包括大麻素（CB）受体、过氧化物酶体增殖物激活受体、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体以及血清素能系统（通过5-HT受体）。它还通过调节炎症通路和L-精氨酸-一氧化氮-环磷酸鸟苷（cGMP）-钾（K⁺）ATP信号级联发挥抗异常性疼痛作用。

然而，Zerumbone在人类细胞系统中对伤害感受器相关离子通道——瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）和脊髓双孔钾通道（TRESK）——的直接功能影响仍缺乏表征。TRPV1是一种被伤害性刺激（如热、酸化和辣椒素）激活的离子通道，导致神经元去极化并产生动作电位（AP），主要分布于背根神经节、三叉神经和迷走神经节的感觉神经元中。TRESK在伤害感受器中高表达，已被鉴定为在功能水平上与TRPV1相互作用，调节TRPV1介导的离子电流。研究表明，TRESK敲除小鼠的伤害感受器比野生型小鼠发放显著更多的动作电位。

尽管啮齿动物研究结果令人鼓舞，但Zerumbone的临床转化因其疏水性、吸收差和低全身生物利用度而受到固有限制。因此，在人类iPSC模型中研究Zerumbone对TRESK和TRPV1介导离子电流的功能效应，进而阐明其降低伤害感受器兴奋性的机制，对于在推进复杂的体内递送系统之前验证Zerumbone的镇痛潜力至关重要。

二、研究设计与主要技术方法

本研究采用多种互补的技术手段系统评估了Zerumbone在人类体外模型中的抗伤害感受特性。主要关键技术方法包括：定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blotting用于检测TRPV1和TRESK的RNA及蛋白表达水平；CellTiter-Blue活力测定和细胞计数用于评估Zerumbone对细胞活力和增殖的影响；Fluo-4 AM荧光钙成像用于检测辣椒素诱发的TRPV1介导的细胞内钙信号变化；全细胞膜片钳电生理记录用于测量TRESK和TRPV1介导的离子电流以及iPSC来源伤害感受器样神经元的动作电位发放特性。研究使用了HEK293细胞（稳定表达TRESK或瞬时过表达TRPV1）、SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系以及人iPSC系BO-VC1来源的伤害感受器样神经元。

三、主要研究结果

直接应用Zerumbone可逆性降低HEK293细胞中TRESK介导的离子电流

通过pico-applicator系统直接应用不同浓度的Zerumbone处理稳定过表达TRESK的HEK293细胞2秒，重复斜坡记录显示最大电流降低。Boltzmann拟合得出实时TRESK抑制的IC₅₀值为259.5 μM。应用接近IC₅₀值的300 μM Zerumbone使TRESK介导的离子电流显著降低（-48.5±3.7%），而溶剂对照仅变化-0.9±1.2%。该效应可通过灌流液洗脱在18.15秒内逆转。

延长Zerumbone处理增加TRESK介导的离子电流

与直接应用相反，通过灌流液给予Zerumbone进行电生理测量时，TRESK介导的外向电流显著增加。从-100 mV至100 mV、步阶10 mV、持续500 ms的电压阶跃记录显示，应用100 nM或100 μM Zerumbone后外向电流增加。100 μM Zerumbone处理后电流-电压曲线下面积（AUC）显著增加（43305±3967对比VC的26726±3462），100 mV输入电压下的电流密度也显著增加（525.8±80.8 pA/pF对比339.1±67.2 pA/pF），最大电流同样显著升高。

Zerumbone降低TRPV1介导的Ca²⁺内流

在过表达TRPV1的HEK293细胞中，100 nM Zerumbone处理后辣椒素诱发的细胞内钙水平显著降低，AUC分析显示Zerumbone组（30901±3834）显著低于溶剂对照组（44586±2997）。全细胞膜片钳记录显示，在+60 mV保持电位下，100 nM Zerumbone存在时10 μM辣椒素诱导的离子电流显著降低（-1.784±0.442 nA对比-3.258±0.580 nA）。在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中，1 μM和100 μM Zerumbone处理均显著降低了辣椒素诱发的TRPV1介导的细胞内钙水平。

Zerumbone降低人iPSC来源伤害感受器样神经元中TRPV1介导的Ca²⁺内流和动作电位发放频率

在iPSC来源的伤害感受器样神经元中，Zerumbone处理组在辣椒素激活后表现出显著降低的荧光响应，AUC值（15790±2190）和峰值RFU值（190.3±68.9）均显著低于溶剂对照组（分别为47801±4919和720.4±206.2）。电生理记录显示，在150 pA去极化电流下，Zerumbone处理组动作电位发放频率（1.20±0.97 Hz）显著低于对照组（3.25±1.91 Hz）；但在360 pA电流下，Zerumbone处理组发放频率（30.20±4.41 Hz）反而显著高于对照组（1.75±0.48 Hz）。Zerumbone处理组静息膜电位（-73.20±3.4 mV）显著低于对照组（-47.57±2.67 mV），基强度电流（172.00±30.72 pA）显著高于对照组（20.00±20.35 pA）。

四、讨论与结论

Zerumbone处理以浓度依赖性方式降低细胞活力和增殖，高浓度抑制细胞生长而低浓度具有促增殖效应，这与既往癌症研究结果一致。但Zerumbone处理不改变TRPV1或TRESK的蛋白表达水平，表明观察到的电生理效应更可能源于对现有离子通道的功能调节而非通道丰度的改变。

直接应用Zerumbone可逆性抑制TRESK电流，提示可能存在直接通道相互作用；而延长灌流给予则增加TRESK电流，两种应用方式产生相反效应，可能反映了不同暴露模式下Zerumbone对TRESK调节机制的差异——急性应用主要反映对通道功能的即时效应，而长期暴露可能允许Zerumbone的细胞内蓄积或激活细胞内信号通路。

在所有研究模型中，Zerumbone一致性地抑制了TRPV1介导的离子电流和钙内流，其机制可能是直接结合并阻塞通道孔道区域或与激动剂辣椒素竞争。在iPSC来源的伤害感受器样神经元中，Zerumbone降低了中等去极化电流下的动作电位发放频率，提高了静息膜电位和基强度电流，表明其通过提高去极化阈值来降低伤害感受器兴奋性，而非普遍抑制神经元兴奋性。

研究结论认为，Zerumbone主要通过抑制TRPV1活性来减弱人iPSC来源的伤害感受器样神经元的兴奋性，而对TRESK的调节则更为复杂且依赖于浓度和应用方式。这些发现为Zerumbone在啮齿动物模型中观察到的抗异常性疼痛效应提供了分子和功能层面的机制基础，支持进一步研究Zerumbone在疼痛管理中的治疗潜力。