《Molecular Pain》：CB1 antinociceptive tolerance is delayed in S426A/S430A mice and accelerated in older mice in the formalin test of inflammatory pain
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炎症性疼痛严重影响患者生活质量，目前缺乏充分的治疗选择。与炎症性疼痛相关的疾病可发生于整个生命周期，但在老年个体中最为常见。公众对 cannabinoids 镇痛潜力的关注日益增加，CB1 受体激动剂已在多种临床前模型中进行了测试。然而，其临床应用可能受到耐受
炎症性疼痛严重影响患者生活质量，目前缺乏充分的治疗选择。与炎症性疼痛相关的疾病可发生于整个生命周期，但在老年个体中最为常见。公众对 cannabinoids 镇痛潜力的关注日益增加，CB1 受体激动剂已在多种临床前模型中进行了测试。然而，其临床应用可能受到耐受性发展的限制。S426A/S430A 转基因小鼠品系先前为探索该耐受性而建立，其两个点突变阻碍了 CB1 受体脱敏第一步的磷酸化。因此，研究人员在福尔马林炎症性疼痛模型中，考察了 CB1 选择性激动剂 ACEA 的镇痛疗效，并采用性别（雌性 vs 雄性）、年龄（3 月龄 vs 12 月龄）和基因型（C57BL/6J vs S426A/S430A）不同的小鼠。ACEA 在所有测试组中均产生显著的镇痛效应，且组间无差异。S426A/S430A 突变在所测两个年龄组中均显著延缓了耐受性的形成。此外，S426A/S430A 突变与 3 月龄雌性、12 月龄雌性及 12 月龄雄性小鼠的体重增加相关。12 月龄小鼠相较于 3 月龄小鼠表现出加速的耐受性发展。在 rotarod（运动协调）、open field（运动能力和中心停留时间）及直肠温度方面均未观察到显著差异。这些结果证明了 CB1 受体激动剂的镇痛益处及其使用中的显著限制（耐受性）。未来需进一步研究 CB1 耐受性发展的机制、S426A/S430A 突变导致体重增加的机制，以及这些发现的潜在临床意义。
炎症性疼痛是多种疼痛状态的重要成因，包括慢性风湿性疾病以及感染、创伤和放射引起的急性疼痛。近年来，公众对 cannabis 及 cannabinoid 类化合物镇痛潜力的关注度显著上升。临床前研究表明，靶向 CB1（cannabinoid receptor 1，大麻素受体 1）受体的激动剂具有显著的抗伤害性感受作用，然而其临床应用普遍受到耐受性发展的制约。耐受性的产生源于 CB1 受体功能与表达的适应性变化，具体机制涉及受体内特定丝氨酸残基的磷酸化修饰，这一过程促使 β-arrestin2 与受体结合，进而介导 G 蛋白解偶联和受体内化。S426A/S430A 转基因小鼠携带 CB1 受体第 426 和 430 位丝氨酸突变为丙氨酸的点突变，其磷酸化位点受阻，从而限制了 β-arrestin2 介导的受体脱敏。
研究人员系统考察了性别、年龄和基因型对 CB1 选择性激动剂 ACEA（arachidonoyl 2'-chloroethylamide）在小鼠福尔马林炎症性疼痛模型中镇痛疗效及耐受性发展的影响。研究中，雄性及雌性 C57BL/6J 野生型（wild-type，WT）及 S426A/S430A 基因敲入（knock-in，KI）小鼠均被纳入，年龄范围涵盖行为学旺盛的 3 月龄（3-month-old，3MO）和中老年阶段的 12 月龄（12MO）。所有小鼠在行为测试期间接受连续 1-7 天（WT 小鼠）或 1-10 天（KI 小鼠）的 ACEA 或溶剂每日腹腔注射 30 分钟后，测定福尔马林诱导的疼痛行为。研究发现，ACEA 在所有基因型、性别及年龄的小鼠中均产生了显著的急性镇痛效应，但耐受性发展速率则表现出基因型与年龄的特异性差异。S426A/S430A 突变可以显著推迟耐受性的出现时间，而老龄则明显加速了耐受性的发生进程。
在主要技术方法层面，研究主要采用了以下关键策略：（1）基于转基因 S426A/S430A 基因突变小鼠模型与 C57BL/6J WT 小鼠对照，以实现对 CB1 磷酸化位点的遗传学干预；（2）应用福尔马林炎症性疼痛模型，通过足底皮下注射稀释福尔马林溶液，并运用复合疼痛评分（composite pain score，CPS）加权评分系统量化观察 60 分钟内小鼠的疼痛行为反应；采用梯形法则计算急性期和炎症期的面积曲线下面积（area under the curve，AUC）比较组间差异；（3）评估小鼠的行为学改变，包括转棒实验和旷场实验以评价感觉-运动协调和自发性活动，以及直肠温度测定用于评估低温效应；（4）实验设计采用重复测量方差分析等统计方法全面分析性别、年龄及基因型对伤害性感受的影响。样本均来自实验室内繁殖的 S426A/S430A 小鼠品系（来自宾州州立大学）以及商业购买的 C57BL/6J 小鼠。这部分实验在对多因素交互作用进行全面分析并控制基线差异后剔除了潜在混杂因素。
结果分析表明，三个主要因素对福尔马林诱导的伤害性感受行为学评分的影响如下：
（1）体质量差异——S426A/S430A 小鼠体重相对高于对照组小鼠具体表现为：3 月龄雌性、12 月龄雌性及 12 月龄雄性 S426A/S430A 小鼠体重皆显著高于同龄同性别的 C57BL/6J 小鼠。该体质量效应具有年龄和性别依赖性。更值得注意的是，在老年小鼠（12MO）中，这种体重差异在两种性别中都存在，而在年轻小鼠（3MO）中只体现于雌性。
（2）镇痛疗效——单次给药（1 天）ACEA 在所有的组别（各年龄和基因型）小鼠中均显示出炎症期显著的镇痛作用，而在某些组别（如 3 MO或 12 MO 的 KI 小鼠）中，给药 3 天或更长时间后镇痛作用依然存在。雄性 3MO WT 小鼠也 获得了短暂但明确的早期镇痛作用。整体而言，ACEA 的镇痛效应不存在显著的性别差异和基因型差异。
（3）镇痛耐受性的时间动力学——在持续的 ACEA 给药条件下，12 月龄小鼠（两种基因型，包括 WT 和 KI）均比各自的 3 月龄对照组更快地失去镇痛反应。S426A/S430A 基因突变显著延缓了耐受性的发生：在 3 MO 时，WT 组的镇痛仅维持在连续给药 5 天，而 KI 组则能维持到 7 天；在 12MO 时，WT 组只能维持 1 天有效，而 KI 组则可延续至 3 天。统计分析证实，在两种年龄和基因型中，老年小鼠相较于 3 MO 均有显著加速的耐受进程，而 KI 小鼠在各年龄均表现出显著的推迟时间。
（4）行为学评价——重复 ACEA 给糖未导致任何组别在转杆实验（rotarod）运动协调能力、旷场（open field）自发活动或中心区域停留时间中显示出显著变化，亦不影响直肠温度。这些排除掉了由运动功能或应激导致的假阳性结果。
总结来看，S426A/S430A 突变对 CB1 耐受性的延缓效果是在福尔马林炎症痛模型中首次展示的，该效应在年轻小鼠和老龄小鼠中均一致地体现。年龄相关的加速耐受也同时在两种基因型中发现。体重效应则揭示出 S426A/S430A 突变可能通过改变 CB1 信号传递与代谢调控网络而影响能量稳态，这对目前基于 CB1 拮抗剂作为减肥药物的研发有重要提示意义。研究人员讨论中指出，本研究中的 ACEA 给药剂量属于低剂量，其未诱发小鼠出现典型的大麻素四联征（镇痛、运动减退、僵住症和体温降低）中的后三种，显示出亚脑效应优先镇痛的治疗窗口。
研究结论部分强调，CB1 受体激动剂在炎症性疼痛模型中具有显著且稳定的镇痛功效，但其使用明显受到耐受性的制约，此耐受性受到年龄的显著加速和小鼠 CB1 突变（S426A/S430A）的推迟。这些效应独立于多巴胺样运动调节和温度调节效果，增重发现的生物学意义及降低耐受性的新策略——如避免磷酸化或靶向 β-arrestin 介导的信号，是未来可行的潜在疗法改进方向。该研究为优化基于 CB1 的治疗策略——既保留其显著的镇痛又最大限度地减弱耐受性展开——提供了明确的动物层面证据基础与理论基础。
