中国健康成年人外周血NK细胞亚群、B细胞亚群及T细胞表面标志物年龄相关重塑的前瞻性多色流式细胞术研究

《Frontiers in Aging》：Age-associated remodeling of NK cell subsets, B cell subsets, and T cell surface markers in peripheral blood of healthy Chinese adults: a prospective multicolor flow cytometry study

　　

背景：免疫衰老（immunosenescence）是指伴随衰老而发生的免疫系统结构与功能重塑，与感染易感性增加、疫苗应答减弱以及慢性病负担加重密切相关。尽管流式细胞术对外周血淋巴细胞亚群的分析已成为表征免疫衰老的关键工具，但关于健康中国成年人中NK细胞亚群（CD56^hi/CD56^dim/CD56^neg三分类）和B细胞亚群（IgD/CD27四分类）的系统性年龄相关数据仍然匮乏。CD57和TEMRA作为T细胞终末分化标志物的定量年龄趋势在该人群中也尚未被完整描述。方法：研究人员前瞻性入组了146名在北京协和医院年度健康体检中心就诊的健康成年人（Panel 1：n=103，年龄20–82岁；Panel 2：n=43，年龄25–92岁，并富集了老年参与者）。Panel 1为12色单管检测，覆盖T细胞（包括CD57）、NK细胞三亚群及基于IgD/CD27的B细胞亚群。Panel 2为12色双管检测，聚焦于详细的T细胞分化状态，包含CD45RA/CD62L、CD28、CD31、CD38和HLA-DR。统计分析采用Spearman秩相关、Kruskal–Wallis和Mann-Whitney U检验。结果：在Panel 1（n=103）中，10个参数显示出显著的年龄相关性。CD4⁺CD57⁺（r=+0.421，p<0.001）和CD8⁺CD57⁺（r=+0.338，p<0.001）随年龄增长最为显著。总NK细胞频率增加（r=+0.259，p=0.008），而CD56^hiCD16^?调节性NK细胞下降（r=?0.263，p=0.007），NK细胞PD-1表达上升（r=+0.256，p=0.009）。在Panel 1中，IgD⁺CD27⁺边缘区样B细胞显著下降（r=?0.257，p=0.009）。Panel 2（n=43）揭示了CD8⁺T细胞中最强的信号：TEMRA积累（r=+0.532）、CD28缺失（r=?0.552）和初始细胞耗竭（r=?0.534）均达到p<0.001。CD4⁺初始细胞也显著下降（r=?0.303，p=0.048）。多变量分析证实大多数关联与性别无关。结论：本研究全面描述了健康中国成年人中NK细胞亚群、IgD/CD27定义的B细胞亚群以及多维T细胞标志物随年龄变化的免疫表型特征，为临床免疫评估和疫苗应答预测提供了参考数据。

研究背景与目的：免疫衰老（immunosenescence）指伴随年龄增长免疫系统发生的结构和功能重塑，在人类表现为感染易感性增加、疫苗免疫原性下降和肿瘤监视受损，并与多种老年相关疾病有关。流式细胞术可精细分析外周血淋巴细胞亚群，T细胞衰老特征如CD28缺失、CD57⁺终末分化细胞积累、TEMRA（终末分化效应记忆细胞，CD45RA⁺CD62L^?）扩增已被广泛认识；CD31作为近期胸腺输出细胞（RTE）标志物，其下降反映胸腺退化；NK细胞中调节性CD56^hiCD16^?亚群随年龄收缩，而细胞毒性CD56^dimCD16⁺占优势，非典型CD56^?CD16⁺亚群可能在慢性感染中扩张；B细胞中IgD/CD27四分类框架可捕捉初始、边缘区样、转换记忆和双阴性（IgD^?CD27^?，年龄相关B细胞）的变化。然而，针对健康中国成年人，整合NK细胞三分类、IgD/CD27 B细胞框架及CD57和TEMRA等终末分化标志物的系统年龄相关数据此前未见报道。因此研究人员开展了两组互补的多色流式细胞术检测，以构建中国成人外周血免疫表型的年龄分层参考数据集。

研究内容与结论概述：研究人员前瞻性入组146名健康成年人，分为两个非重叠队列。Panel 1（n=103，年龄20–82岁）采用12色单管检测，覆盖T细胞（含CD57）、NK细胞三分类和IgD/CD27 B细胞四分类；Panel 2（n=43，年龄25–92岁，富集老年人）采用12色双管检测，聚焦T细胞分化状态（CD45RA/CD62L、CD28、CD31、CD38、HLA-DR）。统计采用Spearman秩相关、Kruskal–Wallis和Mann-Whitney U检验，并通过偏Spearman相关和OLS回归校正性别。结果发现T细胞中CD8⁺T细胞的TEMRA积累、CD28丢失和初始细胞耗竭构成最强年龄相关变化；CD4⁺和CD8⁺的CD57⁺频率显著上升；CD4⁺初始细胞和CD4⁺CD31⁺RTE样细胞下降。NK细胞总频率上升，调节性CD56^hiCD16^?亚群下降，PD-1表达升高。B细胞在Panel 1中仅边缘区样B细胞下降，而在老年富集队列中总B细胞和转换记忆B细胞显著减少。多变量分析显示绝大多数年龄关联独立于性别。研究还构建了免疫复合评分（ICS），与年龄强相关（r=+0.575）。该研究为临床免疫状态评估和疫苗应答预测提供了中国人群参考数据。

关键方法：研究人员从北京协和医院年度体检中心前瞻性招募146名健康成年人（Panel 1：n=103，20–82岁；Panel 2：n=43，25–92岁，富集老年）。Panel 1为12色单管流式检测，包括CD3、CD4、CD8、CD57、Ki67、PD-1、CD56、CD16、CD19、IgD、CD27等。Panel 2为12色双管流式检测，T细胞管加入CD45RA、CD62L、CD28、CD31、CD38、HLA-DR，B/NK管同Panel 1。统计采用Spearman秩相关、Kruskal–Wallis、Mann-Whitney U、偏Spearman相关和OLS回归。所有样本在BD LSRFortessa采集，FlowJo分析。

研究结果：

3.1 研究人群：两个队列合计146名健康成年人，无重叠。Panel 1以男性为主（83.5%），年轻、中年、老年占比分别为50.5%、37.9%、11.7%；Panel 2以老年为主（62.8%），女性比例略高（32.6%）。

3.2 Panel 1中的T细胞变化：在Panel 1（n=103）中，随年龄增长最显著的是CD4⁺CD57⁺（r=+0.338，p=0.002）和CD8⁺CD57⁺（r=+0.308，p=0.002）的积累；总T细胞频率下降（r=?0.256，p=0.009），CD4⁺T细胞比例下降（r=?0.218，p=0.027），CD4⁺Ki67⁺轻度上升（r=+0.201，p=0.042）。合并全部146人后，CD4⁺PD-1⁺和CD8⁺PD-1⁺均与年龄显著正相关。

3.3 Panel 2中的T细胞变化：3.3.1 CD8⁺T细胞：CD8⁺T细胞的TEMRA积累（r=+0.532）、CD28缺失（r=?0.552）和初始细胞耗竭（r=?0.534）均达p<0.001，构成终末分化三联征。同时CD8⁺HLA-DR⁺（r=+0.370）、CD8⁺CD38⁺HLA-DR⁺（r=+0.363）和CD8⁺Ki67⁺（r=+0.375）随年龄上升，提示活化状态仍存在。3.3.2 CD4⁺T细胞：CD4⁺CD31⁺（RTE标志）下降（r=?0.361，p=0.017），CD4⁺初始细胞下降（r=?0.303，p=0.048），其余CD4⁺参数无显著年龄相关。

3.4 NK细胞变化：Panel 1显示总NK细胞频率随年龄上升（r=+0.259，p=0.008），调节性CD56^hiCD16^?亚群收缩（r=?0.263，p=0.007），NK PD-1表达升高（r=+0.256，p=0.009）。合并数据（n=146）中，CD56^?CD16⁺非典型亚群在≥65岁参与者中显著增加（r=+0.482，p=0.002），但在<65岁中无显著关联；斜率变化检验未达显著（p=0.094），提示为晚年趋势。

3.5 B细胞变化：Panel 1中总B细胞频率稳定，仅IgD⁺CD27⁺边缘区样B细胞显著下降（r=?0.257，p=0.009）。Panel 2中总B细胞频率（r=?0.381，p=0.012）和转换记忆B细胞（r=?0.379，p=0.012）显著下降，提示B细胞记忆收缩主要发生在高龄阶段。

3.6 性别效应与多变量分析：Panel 1中5个参数有性别差异，如女性CD4⁺比例更低、CD8⁺比例更高；男性初始B和ABC比例更高。Panel 2中女性CD31⁺比例更高，男性NK频率和CD8⁺记忆更高。校正性别后，Panel 1所有10个显著年龄关联仍存在，Panel 2核心CD8⁺指标仍强显著（p<0.001）。

3.7 免疫复合评分（ICS）：研究选取9个与年龄一致且性别无关的参数构建ICS。在146人中，ICS与实足年龄强相关（r=+0.575，p<0.001）。Kruskal–Wallis显示老年组与青年组、中年组显著分离（p<0.001），而青年与中年差异不显著。ICS为概念验证工具，需外部前瞻验证。

3.8 跨谱系衰老相关性：Panel 1中，CD4⁺CD57⁺与CD8⁺CD57⁺强相关（r=+0.469，p<0.001），并与调节性NK亚群负相关；CD8⁺PD-1⁺与ABC正相关。Panel 2中，CD8⁺TEMRA与CD8⁺CD28缺失（r=?0.775，p<0.001）和CD57积累（r=+0.557，p<0.001）紧密耦合；NK PD-1⁺与CD56^?CD16⁺扩张正相关。这些提示免疫衰老在T、NK、B细胞谱系间部分协同发生。

讨论总结：讨论指出，T细胞中CD8⁺向TEMRA分化伴随CD28丢失和初始耗竭是衰老的核心特征，并与已知T细胞衰老及表观遗传衰老特征一致。NK细胞改变表现为调节亚群收缩和PD-1表达上升，后者可能反映炎症衰老或潜伏病毒刺激导致的类耗竭表型。B细胞衰老更多见于高龄人群，转换记忆B细胞收缩到七旬后才明显。性别差异存在但不影响主要年龄效应。ICS具有临床应用潜力但需外部验证。本研究存在Panel 2样本较小、未测CMV血清状态、横断面设计、性别不平衡、缺乏功能学指标等局限。结论：在146名健康中国成年人中，三个主要淋巴细胞谱系均呈现与年龄一致、且多与性别无关的免疫重塑。CD8⁺TEMRA积累是最强信号，伴有CD28缺失、初始细胞耗竭及CD57积累；CD4⁺初始与RTE样细胞下降提示胸腺输出减少；NK细胞调节亚群收缩、非典型亚群在老年扩张、PD-1升高；B细胞老化相对较晚，包括边缘区样B细胞下降和转换记忆收缩。这些发现定义了中国健康成人外周血免疫系统的多维老龄化轨迹，为临床免疫表型分析和疫苗应答研究提供了参考框架。